A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Effektiv differentiering av postganglitoniska sympatiska nervceller med hjälp av mänskliga pluripotenta stamceller under Feeder-fria och kemiskt definierade kulturförhållanden
Chapters
Summary May 24th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
I detta protokoll beskriver vi en stabil, mycket effektiv differentiering strategi för generering av postganglionic sympatiska nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller. Denna modell kommer att göra nervceller tillgängliga för användning av studier av flera autonoma sjukdomar.
Transcript
Detta protokoll gör det möjligt härledning av sympatiska nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller. Dessa celler kommer att göra det möjligt för en forskare att studera mänskliga sjukdomar som påverkar det sympatiska nervsystemet. Denna teknik gör härledning av sympatiska nervceller i uppdelade feeder-free mötesförhållanden vid en hög skalbar effektivitet.
Det resulterar i elektriskt aktiva nervceller i 20 dagar. Denna teknik kan tillämpas på sjukdomar som orsakas av en dysfunktionell sympatiska nervsystemet, Det också kan användas för sjukdom modellering, regenerativ medicin, och drog screening. Dessa celler skulle kunna användas in vitro för att förnya någon vävnad inom ett samkultursystem, till exempel för studier av hjärtvävnadsreglering.
När den mänskliga pluripotenta stamcellskulturen når 80 till 90%konfluency, bör stora kolonier med släta ljusa kanter observeras. För klyvning, tvätta kulturen med PBS innan du behandlar cellerna med fyra milliliter på 0,25 molar EDTA vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. Efter två minuter spolar du plattan med 10 milliliter E8-medium och överför den fristående cellupphängningen till ett koniskt rör på 15 milliliter.
Överför sedan 500 mikroliter celler till en 9,5 milliliter alikvot av färskt E8-medium. Och tallrik stamcellerna på nya vitronectin belagda 100 millimeters rätter. En dag före differentiering induktion, päls lämpligt antal sex brunnsplattor med två milliliter av källaren membran matris per brunn.
Och förvara plattorna i fyra grader Celsius över natten. Nästa morgon, värma plattorna till rumstemperatur och tvätta redo att dela mänskliga pluripotenta stamcellskultur två gånger med färska PBS per tvätt. Efter den andra tvätten, behandla cellerna med sju milliliter på 0,5 millimolar EDTA i 15 minuter i cellodlingsinkubatorn innan de aspirerar de flytande mänskliga pluripotenta stamcellerna och överför de skördade cellerna till ett 50 milliliterrör.
Tillsätt en lika stor volym PBS till röret för att späda ut EDTA och samla in cellerna genom centrifugeringen. Resuspend pelleten i en milliliter av dag 01 differentieringsmedium innan du lägger till en lämplig volym medium för redovisning. Späd cellerna till en 1,25 gånger 10 till den femte celler per kvadratcentimeter koncentration i milliliter av differentiering medium per brunn.
Aspirera alla källaren membranmatrislösning från varje brunn av den tidigare beredda till sex väl platta. Sedan utsäde två milliliter celler i varje brunn och placera plattan i cellkulturen inkubatorn. Nästa morgon, mata cellerna med tre milliliter dag 01 differentiering medium per brunn.
På dag två av differentiering, mata cellerna med tre milliliter dag två till 10 differentiering medium per brunn, mata sedan cellerna varannan dag fram till dag 10. För att aggregera neurala crest celler i sfäroider, på dag 10, tvätta cellerna med PBS. Och tillsätt två milliliter dissociation medium till varje brunn.
Efter 20 minuter i inkubatorn för cellodlingen, överför du de flytande cellerna till ett koniskt rör på 50 milliliter och för upp suspensionens volym i röret till 50 milliliter med färsk PBS. Samla in cellerna genom centrifugeringen. Och resuspend pelleten i en tillräcklig volym av dag 10 till 14 sfäroid medium för räkning.
Efter räkning, späd cellerna till en fem gånger 10 till de femte cellerna per 500 mikroliter koncentration med hjälp av dag 10 till 14 sfäroid medium. Och platta 500 mikroliter celler i varje brunn av en ultra låg fastsättning 24-brunnsplatta. Sedan tillbaka cellerna till cellodlingen inkubatorn.
För att inducera en minimal sfäroid kultur, på dag 11 av kultur, mata neurala krönet sfäroider med ytterligare 500 mikroliter dag 10 till 14 sfäroid medium per brunn. På dag 12, luta plattan för att ackumulera sfäroiderna på ena sidan av plattan. Och försiktigt aspirera så mycket medium som möjligt från varje brunn utan att aspirera sfäroider.
Mata sedan sfäroiderna med en milliliter dag 10 till 14 sfäroid medium per brunn. För att inducera en utökad sfäroidkultur, på dag 15, mata sfäroiderna med 1,5 milliliter dag 10 till 14 sfäroid medium kompletterat med 0,5 mikromolar retinoinsyra per brunn. Sedan tillbaka sfäroiderna till cellkulturens inkubator.
För sympatisk neuron differentiering, på dag 14 eller 28, luta plattan för att ackumulera sfäroiderna på ena sidan av plattan och försiktigt aspirera så mycket medium som möjligt. Mata cellerna med en milliliter av sympatiskt neuron medium. För att bryta upp stora sfäroid aggregat i mindre sfäroider, tillsätt inte mer än en milliliter medium per brunn och pipettera sfäroiderna fem till 10 gånger innan uppdelning.
Och ta bort överskottet laminin fibronectin från tidigare beredda 24-brunnsplattor. Dela plattan en milliliter av sfäroider från varje brunn på 24-brunnar sfäroid kultur plattan mellan fyra separata brunnar av den nya belagda 24-brunnsplattan. Lägg till 250 mikroliter av färskt sympatiskt neuron medium till varje brunn.
Och placera plattan i cellkulturens inkubator. Nästa morgon, ersätta mediet i varje brunn med en milliliter av sympatisk neuron medium kompletteras med 0,125 mikromolar retinoinsyra och returnera plattan till cellkulturen inkubatorn. Efter dag 35, mata nervceller genom att noggrant ersätta endast hälften av det befintliga mediet i varje brunn med färskt medium.
Före differentiering bör de mänskliga pluripotenta stamcellskolonierna vara runda med blanka, släta kanter och liten till ingen differentiering. Cellerna uttrycker neurala krönet markör Sox10 från dag fyra till 10. Neurala crest celler framträder i tät förmörkad åsar som är synliga från dag sex på.
Dessa åsar uttrycker också Sox10. På neurala crest celler skede, Sox10 korrelerar med cellytan markör CD49D, som kan användas för att sortera neurala crest celler. Positiva sorterade och osorterade populationer producerade neurala crest sfäroider på ett liknande sätt.
Medan negativa sorterade celler inte aggregerar ordentligt, producerar inte runda, släta friska letar sfäroider och dör inom tre till fyra dagar. Dessutom, när neurala crest sfäroider jämförs på dag 14, den kvantitativa omvänd transkriptas PCR för neurala crest och sympatiska nerv progenitor markörer, betydande skillnader mellan sorterade och osorterade celler kan inte upptäckas. Dag 20 eller 35, respektive minimala eller utökade protokoll, neuroider kan observeras växer i ett radiellt mönster från de bifogade sfäroiderna.
Markörer relaterade till noradrenalin syntes och transport uttrycks i detta skede, liksom Hox6 genom nio bål neurala crest gener. Elektrofysiologisk inspelning upptäcker också neural aktivitet från dag 20 på. Sådan aktivitet kan förstärkas eller undertryckas av läkemedel som riktar autoreceptorer av sympatiska nervceller justera funktionaliteten hos differentierade nervceller.
Den mänskliga förespråkaren själva måste vara friska börjar på dag noll av differentiering, annars kommer experimentet sannolikt misslyckas. Farmakologiska hämmare eller aktivatorer kan läggas till neuronerna för att förstå deras normala eller patologiska beteende. Denna metod öppnar en ny väg för att studera sympatisk biologi och patologi eftersom det nu är möjligt att få biopsier av sympatiska nervceller från människor lätt.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
