Immunology and Infection
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无标记基因删除由絮凝血盒等位基因交换突变在衣原体沙眼
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Summary January 30th, 2020
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本文描述的是使用絮状盒状体等位基因突变（FLAEM）在衣原体沙眼中进行靶向、无标记基因删除的方法。
Transcript
Floxed盒式细胞细胞交换突变是一种重要的方法，因为基因缺失是一种有价值的工具，可用于了解基因产品的功能。这项技术的主要优点是，它允许靶向基因删除，而不会对下游基因造成极性影响。确定直接上下游大约三个千基区域，作为用于同源重组的五个主源和三个主同源臂，并按文本协议所示分配底像。
在一到两个反应中，通过 PCR 将新提取的衣原体基因组 DNA 中的三千基五原和三个原源和三个原源臂放大，从而产生足够的片段，供以后的 DNA 组装。在按照文本协议中描述的进行PCR片段的净化和浓缩后，根据制造商的协议，在20微升反应中消化500纳米的pSUmC-4.0向量，其中一个单元为一单元，一个单元为SBF。将消化和纯化的 pSUmC-4.0 向量和五个主源和三个主同源臂 PCR 产品组合在一起，其比例为 0.01 皮毛量向量与每个同源臂的 0.09 象形体。
根据制造商的协议，在DNA组装反应中组装碎片。使用一个微升的DNA组装反应，转化50微升的电力大肠杆菌。将转化后的大肠杆菌板板上，每毫升含有100微克的斑点霉素。
在37摄氏度下孵育板过夜。第二天，使用荧光倒置显微镜筛选绿色和红色荧光的菌落。预计每个阿加板总共有5到30个菌落。
在选定菌落的隔夜液体培养孵育后，使用 PCR 筛选底法确认将每个同源臂插入载体，以放大每次插入。种子麦考伊细胞是小鼠成纤维细胞，通常用于培养衣原体成两个六孔板，如文本协议所述。在1.5毫升管中，加入C.沙眼野生型血清L2基本体，或EBs，体积足以感染12孔的六孔板在2的MOI。
将 EBs 以大于 20，000 倍 g 的价格进行 30 分钟，然后丢弃上一液。在 600 微升氯化钙缓冲液中轻轻重新吸收 600 微升的 EB，启动菊花转化。然后，将 12 微克的 pSUMC-4.0 加同源臂添加到管子中，然后轻拂混合溶液。
在室温下孵育管子30分钟，每10分钟混合一次。将转化溶液加入 24 毫升 HBSS，然后轻轻移液混合。将两毫升的 inulum 转移到六孔板中每一个汇合麦考伊细胞井中。
在20摄氏度下以900次g离心感染，一小时。取出 inoulum，并更换为每井两毫升 RPMI 生长介质 2 号。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育板。
至少7小时后，但不超过12小时，更换介质与两毫升每井选择介质1号。从感染时起，在37摄氏度下继续孵育48小时。使用细胞刮刀轻轻刮擦麦考伊单层将细胞提升至介质中，将细菌收集并传递到麦考伊细胞的新鲜单层上。
将材料从每一个井转移到两毫升管中。在4摄氏度的微离心中，在大于20，000倍g的细胞材料中，在30分钟内进行。丢弃上一提液后，通过轻轻移液将细胞颗粒重新在一毫升的HSSS中。
在4摄氏度下以200倍g的温度下将细胞碎片取出5分钟。将上流液转移到一个新鲜井的汇合麦考伊细胞。在每个井中再加一毫升的HS，每井的总体积为2毫升。
在20摄氏度下以900次g离心感染，一小时。感染后立即将选种介质更换为选择介质。继续每48小时将细菌传到麦考伊细胞的新鲜单层上，直到感染后24小时使用荧光倒置显微镜检测到红色和绿色内含物。
检测到红色和绿色内含物后，继续像使用选择介质 2 之前一样传递单层。继续传递单层，直到感染后24小时检测到仅绿色内含物，表明pSUMC-4.0载体丢失，并加入loxP选择盒到基因组中。收获并冻结 SPG 中仅绿色内含物。
将绿色包含物丰富到介于 0.5 和 1.0 之间的 MOI 中，并像本文中所述将单层收获到 SPG 中。在1.5毫升管中获得50微升的等分，并在零下80摄氏度下冷冻。种子384井组织培养板与麦考伊细胞，如文本协议所述。
稀释HBSS中仅绿色细菌的等分，达到每20毫升约50微克。将稀释的 inulum 转移到储液罐托盘中。将整个盘子倒置到废物容器中，从384井的汇合McCoy细胞板中去除介质。
使用多通道移液器，在每孔中加入50微升的C.沙眼 inulum。在20摄氏度下以900次g离心感染，一小时。通过轻拂去除 inoulum，并更换为每井 50 微升的生长介质 2 号。
用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育板。在孵育板5至12天后，使用荧光倒置显微镜或高含量筛选平台识别具有绿色荧光内含物的单个孔。通过用 P10 尖端刮刮单层，收获带绿色内含物的井。
将整个井内装物转移到含有两毫升HSS的管子中。轻轻混合并应用两毫升的 inoculum 到六井板中新鲜汇合的麦考伊单层，以进行感染。丰富、冻结和滴度克隆种群。
使用定量PCR确认从克隆分离的C.沙眼中删除靶向基因。使用克隆分离的 C.沙眼 FRAEM 突变体、pSU-Cre 向量和选择介质三重复转换过程。通过单层，直到检测到仅红色内含物，表示选择盒丢失。
与以前一样，通过限制 384 井板中的稀释，克隆分离仅红色内含物。通过传递到0.1的MOI来丰富克隆种群。一旦丰富，将选择介质替换为生长介质 2，以启动 pSU-Cre 矢量的损失。
一样克隆分离非荧光细菌。但是，使用 Brightfield 显微镜手动扫描板以检测内含物。丰富和冷冻细菌。
使用定量实时PCR、西印迹和全基因组DNA测序（如前所述）筛选突变菌株。代表性数据显示，tmeA 是基因删除的目标。C.沙眼tmeA-lx菌株使用FRAEM生成，C.沙眼tmeA-lx菌株使用FLAEM生成。
显示 pSUC-4.0 选择盒中包含的 tmeA 和下游 tmeB 的相对 DNA 拷贝数和 2000 年图的 cre。两种突变菌株都含有 tmeA 位点的缺失。然而，tmeA-lx不包含选择盒，如没有g9p DNA所示。
tmeA突变菌株减少了tmeB的表达，如mRNA和蛋白质水平所示。当FLAEM用于生成tmeA-lx突变菌株时，tmeB的表达被mRNA和蛋白质水平检测到。仔细构建具有同源臂的 pSUmC 载体对于有针对性地删除基因至关重要。
在衣原体变换之前，应花时间确保准确的矢量装配。FLAEM为研究人员提供了一个工具，可以研究特定基因，在不减少目标基因表达的情况下进行有针对性的删除，这可能混淆了研究。FLAEM产生的C.沙眼缺失突变体可用于研究衣原体生物学的各个方面，包括发育和致病机制。
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