This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Morfologisk og funksjonell evaluering av axoner og deres synapser under Axon Death i Drosophila melanogaster
Chapters
Summary March 16th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her gir vi protokoller for å utføre tre enkle skadeinduserte aksondegenerasjon (axon død) analyser i Drosophila melanogaster for å evaluere morfologisk og funksjonell bevaring av avkuttede aksoner og deres synapser.
Transcript
Det overordnede målet med denne Drosophila skade protokollen er å observere både bevaring av aksonal og synaptisk morfologi, samt synaptisk funksjon av aksoner og deres synapser. Disse analysene kan også brukes til å karakterisere nevronale vedlikeholdsfaktorer, studere aksonal transport eller analysere aksonale organeller i intakte aksoner. Den delvise vingeskadeanalysen gjør det mulig å observasjon av skadde aksoner som gjennomgår degenerasjon side om side med uskadede kontrollaksoner i samme nervebunt i Drosophila-fløyen.
Denne skadeanalysen kan lett praktiseres på forhånd i villtypefluer ved å bruke et kutt omtrent midt i vingen med mikrosaks. Den indre skaden gjør det mulig å vurdering av aksonal morfologi og ved bruk av optogenetikk for å visualisere funksjonell bevaring av akson og deres synapser. Antenneablasjon krever stødige hender.
Det anbefales også å øve på fjerning antennene i villtype fluer på forhånd. I avhengighet er ethvert tilgjengelig optogenetics-oppsett egnet for å aktivere nevronene i fly med lue. Ellers kan et enkelt oppsett lett bygges fra bunnen av.
Til å begynne med, bruk fem jomfrukvinner og fem menn fra riktig genotype for å utføre kors ved romtemperatur. Overfør P0-generasjonen til nye hetteglass hver tredje til fjerde dag. Samle nyeclosed voksen avkom F1 generasjon daglig i nye hetteglass og alder dem i syv til 14 dager.
Etter bedøvelse, bruk mikrosaks for å kutte den indre vingevenen omtrent midt i vingen. Bruk den ene vingen for skaden og den andre vingen som en alder matchet uskadet kontroll. Påfør en skade per vinge og sørg for å få 15 vinger skadet.
Gjenopprett fluene i mat som inneholder hetteglass. Deretter, med en pipette, spre 10 mikroliter halokarbonolje 27 langs et helt glasssklie. En eller syv dager etter skade, bruk mikrosaks til å kutte av de skadde samt den uskadede kontrollvingen.
Bruk pinsett til å gripe vingen i midten, montere maksimalt fire vinger i halokarbonoljen 27 og dekke dem med et dekselsklie. Bilder av GFP merkede nevroner i vingen kan lett kjøpes med en spinnende disk. Imidlertid må oppkjøpstiden utføres innen mindre enn åtte minutter etter montering av vingene fordi parabolen ikke er fast.
Bilde vingen umiddelbart ved hjelp av et spinnende diskmikroskop. Skaff deg en rekke optiske seksjoner langs Z-aksen med 0,33 mikrometertrinnstørrelse og komprimer Z-stabler til en enkelt fil for etterfølgende analyser. Kryss fem jomfrukvinner og fem menn fra riktig genotype og samle F1 generasjon som tidligere.
Etter bedøvelse, bruk pinsett for å oblate høyre tredje antennesegment for ensidig ablasjon eller både venstre og høyre tredje antennesegmenter for bilateral ablasjon. Dette fjerner GFP merket nevronale cellelegemer mens deres aksonale projeksjoner forblir i CNS. Avhengig av GFP merket nevroner som brukes i teknikken, er det viktig å vite om cellelegemene er plassert i tredje eller i det andre antennesegmentet for den påfølgende skadeanalysen.
Gjenopprett fluene i mat som inneholder hetteglass. Etter bedøvelse, bruk pinsett for å ta tak i nakken og en annen pinsett for å fikse thoraxen. Trekk forsiktig nakken og hodet av thoraxen.
Ved hjelp av pinsett som har blitt dyppet i festeløsningen, overfører du alle hoder til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør som inneholder en milliliter festeløsning på 4% paraformaldehyd og 0,1 triton X100 i PBS. Fest hodene i 20 minutter med mild agitasjon ved romtemperatur. Legg deretter mikrocentrifugerøret på is og hodene beveger seg til bunnen av mikrocentrifugerøret.
Fjern det overnaturlige med en pipette og legg til en milliliter vaskebuffer som inneholder 0,1 % triton X100 i PBS. Plasser røret på et dreiehjul ved romtemperatur for å vaske i to minutter. Gjenta vasken fire ekstra ganger for å fjerne restfesteløsning.
Etter å ha forberedt hjernen, få et deksel lysbilde, stick lab tape på den, og kutte ut en T som form fra båndet. Bruk en pipettespiss på 20 til 200 mikroliter der tre millimeter av spissen er avskåret for å utvide åpningen av pipetten. Pipette hjernen inneholder antifade reagens på lysbildet og dekke hjernen med et deksel lysbilde.
Bruk leire til å forberede to små jevne ruller. Sørg for at leirerullene ikke er høyere enn høyden på et glasssklie. Stick leire ruller på glasssklie og plassere hjernen inneholder deksel lysbilde sandwich på leire ruller.
Fortsett i henhold til manuskriptet. For å forberede fluene for optogenetikk, smelt først flymat i en mikrobølgeovn. Etter at maten er avkjølt, før størkning, tilsett 20 millimolar alle trans-Retinal i etanol til en endelig konsentrasjon på 200 mikromos.
Bland godt og hell maten umiddelbart i tomme hetteglass. Dekk hetteglassene som inneholder størknet mat med plugger eller bomullsboller. Pakk hetteglassene med aluminiumsfolie.
Deretter oppbevarer du maten som inneholder hetteglass i et mørkt kaldt rom. Bruk fem jomfrukvinner og fem menn fra riktig genotype til å utføre kors ved romtemperatur og samle F1 generasjon som tidligere i aluminium dekket hetteglass som inneholder 200 mikromos alle trans-Retinal i flymat. Deretter samler du fluene ved å tappe dem fra mat som inneholder hetteglass i et tomt hetteglass uten mat.
Avkjøl hetteglasset ned i is som inneholder vann i ca. 30 sekunder. Fluer sovner. Nå, raskt sette individuelle fluer i små kamre dekket et deksel lysbilde for å utføre optogenetikk.
I et mørkt rom utfører du protokollen bestående av 30 sekunder der det røde lyset er fraværende, etterfulgt av 10 sekunder med eksponering for rødt lys ved 10 Hertz. Gjenta denne prosedyren tre ganger totalt etterfulgt av et ekstra 30 sekunders intervall der det røde lyset er fraværende. Samle individuelle fluer fra hvert kammer på karbondioksidputer.
For å utsette dem for antenneskade, ablate både venstre og høyre andre antennesegmenter. Dette fjerner cellelegemene til Johnstons organnevroner mens aksonære projeksjoner forblir i CNS. Gjenopprett fluene i aluminiumsbelagte hetteglass som inneholder 200 millimolar alle trans-Retinal.
På tilsvarende tidspunkter, for eksempel syv dager etter antennel ablasjon, utsette fluene til en annen grooming analyse. I denne protokollen ble tre metoder presentert for å studere morfologien og funksjonen til avskårne aksoner og deres synapser. Den første metoden gjør det mulig for høyoppløselig observasjon av individuelle aksoner i det perifere nervesystemet.
De skjematiske kors for å generere vill-type og highwire kloner i vingen er vist her. Kontrollen i skadde GFP-merkede aksoner presenteres også med piler som indikerer avkuttede aksoner. Den andre tilnærmingen til å studere axon død av GFP merket sensoriske neuron aksoner i hjernen presenteres.
Skjematiske kors for å generere vill-type og highwire kloner i hjernen er vist her. Eksempler på kontroll i skadde GFP-merkede aksoner presenteres med piler som indikerer avkuttede aksonbunter. Den tredje metoden demonstrerer tilnærmingen til å visualisere aksonal og synaptisk funksjon etter akotomi.
De skjematiske korsene for å generere villtype og dnmnat over-uttrykke Johnstons organsensoriske nevroner er vist her. Wild-type fluer er fluer som inneholder Johnstons organnevroner med dempede axon død. Begge hadde en potent grooming oppførsel før skade.
Men syv dager etter skade, grooming klarte ikke å bli fremkalt av optogenetikk i vill-type fluer, mens dyrene med dempede axon død fortsatte å stelle. Her bruker vi tap av funksjonsmutasjoner eller vårt uttrykk for gener for å observere bevaring av aksonal morfologi eller synaptisk funksjon. Andre modifiserende metoder kan brukes, for eksempel slå ned RNA-interferens eller vevsspesifikke CRISPR-Cas9 medierte utslag.
Disse metodene kan brukes i en skadeuavhengig sammenheng. De tillater observasjon og karakterisering av nevronale vedlikeholdsfaktorer under aldring, aksonal transport og aksonale organeller i intakte aksoner.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
