A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Hayvan Kokusu Sinyallerinin Örneklemesi ve Analizi
Chapters
Summary February 13th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Koku sinyallerinin hayvan iletişiminde nasıl kullanılabileceğini anlamak için örnekleme ve analiz için etkili bir metodoloji geliştirdik. Özellikle, hayvan kokularının ve koku işaretlerinin uçucu bileşenlerini analiz etmek için gaz kromatografisi-kütle spektrometresi ile birleştiğinde kafa boşluğu katı faz mikrokstrasyonu kullanıyoruz.
Transcript
Kokunun hayvan iletişiminde oynadığı rol şu anda küçümseniyor ve çok yetersiz. Özellikle insanlar da dahil olmak üzere hayvanlardaki koku sinyallerini destekleyen kimyasal değişiklikler hakkında çok az şey bilinmektedir. Ve bunlar aynı zamanda metodolojik zorluklardan, hayvanlar tarafından iletişim kurmak için kullanılan kokuların kimyasal bileşiklerini kaydetmekten ve ölçmekten kaynaklanmaktadır.
Son derece karmaşık kimyasal karışımlarla çalışırken çeşitli potansiyel zorluklar vardır ve bunlar koku örneklerini örnekleme ve analiz ederken de içerir. Hayvanlar arasında iletişim kurduklarında nasıl kullanılabileceğini anlamak için hayvanlar tarafından kullanılan kokuların analizini yapıyoruz. Hayvan iletişiminde kokunun oynadığı rolü anlamamızı geliştirmek için Sitokimya ile Biyoekoloji endokrinoloji ve sitolojiyi birleştirdik.
Wolverhampton'daki mevcut metodolojimiz için, headspace katı faz mikroyapı tekniğini gaz kromatografisi kütle spektrometresi ile birleştiğinde benimsedik, üzerine inşa edildi ve geçmişte metodolojinin görünmeyen bir kısmı kullanıldı. Örnek kokular aşağıdaki yollardan biriyle toplanır. Birincisi, alışılmış çalışma deneklerinden kendiliğinden salınan örnek kokular.
Örneğin, hayvanat bahçesi primatları, steril filtre kağıdında veya idrar örneklerinde koku işareti yaparak koku bezi koku salgılarını doğrudan şişelere toplar. İki, eğitim sonrası çalışma konuları pozitif takviye kullanarak koku salgılarını steril pamuklu çubuklarla koku bakışını ovalayarak toplar. Üç, çalışma deneklerinin yatıştırıcıdan sonra, koku bezlerini steril pamuklu çubuklarla ovalayarak, steril 10 mililitre vidalı kapaklı, şeffaf cam şişelere ve P T T E silikon sektörünü içeren vidalı kapaklı contaya sokarak koku salgılarını toplar.
Şişeleri hemen eksi 20 santigrat derecede saklayın. Örnekleme sırasında nitril eldiven gibi temiz kişisel koruyucu ekipmanların kullanılması hayati önem taşımaktadır. Eldivenleri değiştirin Sık sık numuneler ve şişelerle doğrudan cilt temasından kaçının.
Yepyeni şişelerin kullanılması tercih edilir. Bununla birlikte, kullanılmış şişeler durumunda, şişeleri önceden temizlemek ve ardından aynı protokolü kullanmak çok önemlidir. Koku işaretleri her toplandığı zaman çevresel boşluklar alın.
Örnekleme yapılırken kullanılmayan bir filtre kağıdını veya pamuklu çubuk ve şişeleri çevreye maruz kalarak bunu yapın. Sahada numuneler hazırlanır. İşaretli bir filtre kağıdı kokusu için kağıttan yaklaşık 10 milimetre kare kesin ve 10 mililitre vidalı tepeli kafa boşluğu şişesine yerleştirin.
Bir çubuk için, çubuk milinin en ucundaki çubuk başını kesin ve bir kafa boşluğu şişesine yerleştirin. Her numune hazırlandıktan sonra, örnekleme ortamını kesmek için bıçak kullanımını uygun bir antibakteriyel silme ve veya alkolle atın veya temizleyin ve iyice kurulayın. Tüm örnekleri eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Bununla birlikte, numuneler eksi 20 santigrat derecede saklanmalıdır, ancak en düşük sıcaklıktaki tarla deposunda ve ilk fırsatta eksi 20 santigrat dereceye aktarılmalıdır. Analizden önce numuneleri dondurucudan çıkarın ve en az bir saat boyunca doğal olarak oda sıcaklığına yürümesine izin verilir. SPMS analiz koşulları için GCMS'deki analitik yöntemleri aşağıdaki gibi ayarlayın, ilk kullanımdan önce SBME fiberlerini koşullamak için üreticinin yönergelerini izleyin.
SBME tertibatın otomatik numune alma sistemine doğru şekilde monte edilmiş olması ve otomatik örnekleyici tepsileri fiber şartlandırma ünitesine ve GC giriş portu ile hizalanmış olması hayati önem taşımaktadır. Yanlış hizalama, Sbme lifinin hasar görmesine veya tahrip olmasına neden olabilir. Fiber şartlandırma ünitesine levrek gazı beslemesinin açık olduğundan emin olun.
Örnek saklama süresi tutarlılığı arasında iyileştirme yapmak için, analitik yöntem saklama süresi kilitli numune şişelerini otomatik örnekleyici tepsisine ekleyin otomatik örnekleyici tepsisinin ilk konumunda sistem boş olarak hareket etmek için boş bir kafa boşluğu şişesi yerleştirin. Çevresel boşluğu ikinci konuma yerleştirin ve ardından analiz için kalan tüm numuneleri otomatik örnekleyici tepsisinin sonraki konumlarına yerleştirin. Örnek tepsisteki her örneği analiz etmek için analitik bir sıra oluşturun.
Kitle avcısı giriş ekranında, menü çubuğu için sırayı seçin ve ardından açılır menüden sırayı yükleyin. Boş bir sıra tablosu görüntülenir, tamamlanmış sıra tablosu olarak kaydetmek için uygun bilgileri ekleyerek tüm boşluklar ve örnekler için sıra tablosunu tamamlayın. Sıra tablosu için kesin bilgilerin tablonun laboratuvar biçimlendirmesine bağlı olacağını unutmayın.
Minimum bilgiler normalde örnek türü örnek adını, dosya konumunu ve sayı analitik yöntemini ve veri dosyası konumunu ve gelecekteki veri işlemede örnek adla eşleşen bir veri dosyası adının ad ayırmasını içerir. Analiz sırasında sıraya ek örnekler eklenebilir. Menü çubuğundan sırayı seçerek sırayı çalıştırın ve sonra sırayı çalıştırın.
Analizden sonra numuneler en kısa sürede dondurucuya iade edildi. Örneklerin yeniden analiz edilebileceğini unutmayın. Ancak, bazı uçucu bileşenlerin ilk analiz sırasında tamamen çıkarılmış olabileceği ve bazı bileşiklerin 40 santigrat derecede termal ve bakteriyel ayrışmaya uğramış olabileceği belirtilmelidir.
Bu nedenle, kromatogramdaki sonuç orijinal koku işaretini tam olarak temsilemeyebilir. İlk veri analizi, saklama süresi ve tepe alanı verilerini elde etmek için kromatogramların entegrasyonunu ve kam istasyonu yazılımı ve yuva kütle spektral veritabanlarını kullanarak tepelerin belirsiz bir şekilde tanımlanmasını içerir. Veri analizi manuel olarak veya yarı otomatik bir yöntemle gerçekleştirilebilir.
Yarı otomatik yöntem kullanılırsa, belirsiz tanımlamaları doğrulamak için bir dereceye kadar manuel veri analizi yapmak bazen faydalıdır. Veri çözümlemesi başlatmak için, sol gezinti çubuğundaki uygun dosyayı tıklatarak veri dosyasını açın. Toplam iyon kromatogram TIC, veri analizi ekranının üst penceresinde görüntülenir.
RTE entegratörü kullanarak TIC'yi tümleştirmek için, önce menü çubuğundan kromatogramı seçin ve ardından açılır menüden bir açılır kutu açılır ve RTE entegratörünün öğesini seçin. Kromatogram menüsüne geri dönün ve şimdi tümleştir'i seçin. Tümleştirme parametrelerini, tepelerin veya üç kattan büyük temel gürültünün tümleşik olmasını sağlamak için, menü çubuğundan kromatogramı ve ardından açılır menüden MS Signal tümleştirme parametrelerini yeniden seçin.
Açılır kutuda, minimum tepe alanını uygun 1.0 olarak ayarlayın, örneklerimizde kabul edilebilir sonuçlar üretir. Tepeleri tanımlamak ve özet rapor oluşturmak için, menü çubuğundan raporları dışa aktar'ı seçin ve ardından arama sonuçları raporunu XLS'ye kitaplayın. Bir kitaplık araması yapılmadan önce, görüntülenecek kitaplık eşleşmelerinin sayısıyla birlikte aranacak spektral kitaplıkların yazılım içinde önceden ayarlanabilmesi gerekir.
Elde edilen elektronik tablo raporu, her tepe noktası için tümleştirme verileri ve kimlik atamak için belirsiz bir spektral kitaplık eşleşmesi içerir. Genellikle kitaplık kalitesi veya kitaplık eşleşmesi belirsiz tanımlamayı kabul etmek için 80'den büyük olmalıdır. Elektronik tabloyu kaydedin.
Doğrudan TIC'den bir tepeyi tanımlamak için ilginin zirvesini seçin. Tepe noktası küçükse, tepenin etrafına bir kutu çizerek, sol fare düğmesini basılı tutarak kutuyu tepenin üzerine uzatın ve fare düğmesini bırakın. İmleç çizgisini tepenin en yüksek noktasına veya hemen sonra olacak şekilde yerleştirin.
Çift tıklayın, sağ fare düğmesi ve tepe için kütle spektrumu veri analizi ekranının düşük penceresinde görünecektir. Spektral kitaplıkta arama yapmak için, imleci spektral pencerede herhangi bir yere taşıyın ve sağ fare düğmesini çift tıklatın kitaplık arama sonuçları yeni bir pencerede görünecektir. Önce ilgi spektrumundan arka plan gürültüsünü kaldırmak için, söz konusu tepedeki sağ el fare düğmesini çift tıklatın, ardından ilgi zirvesinin hemen önünde tepe noktası olmayan bir alanda sağ el fare düğmesini tıklatın, menü şeridindeki çıkar düğmesine tıklayın veya menü çubuğu için kromatogramı seçin ve ardından açılır menüden spektrayı çıkarın.
Çıkarılan spektrum, veri çözümleme ekranının alt penceresinde görüntülenir ve pencere başlığındaki tarama verilerinin yanında bir tire görüntüler. Bu protokolün ardından, kırmızı fırfırlı lemurlar tarafından filtre kağıdına kendiliğinden salınan 14 genital koku işaretinin analizinden toplam 32 uçucu kimyasal bileşik belirledik ve koku profillerini hidrokarbonlar gibi sinyalcinin doğal olarak oluşan uçucu bileşiklerin özellikleriyle karşılaştırdık, terpenes, Turpin alkolleri ve ketonları bu profillerde mevcuttu ve daha önce seks hormonları ve fitness ipuçları olarak işlev bulduğu tespit edilen bileşikleri içerir. diğer hayvan türlerinde. Belirsiz bir şekilde tanımlanan bileşikler tablo 1'de listelenmiştir.
Temsili kromatogramlar bir kontrolden ve bir Lima koku işaretinden şekil bir olarak gösterilmiştir. Bileşenlerin sayısı ve göreceli bolluğu, farklı çalışma konularında numuneden örneğe değişmektedir. Bununla birlikte, kromatogramda A'dan F'ye etiketlenmiş altı bileşik tüm örneklerde mevcuttu.
Bu bileşikler sırasıyla E'nin bir altılı parakristal parakristal altı paramentha iki sekiz boya bir iki pinene dört ve pentodecane yüksekliğe kadar büküldü. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, kırmızı fırfırlı lemurların, sosyo cinsel iletişimde rol oynayan genital işareti olmayan seks ve kadın yaşı hakkında bilgi iletmek için gönderilen işaretlemeyi kullandığını öne sürmektedir. Bu protokolün kullanılmasını takiben bir başka temsili sonuç, dişi zeytin babunları tarafından doğurganlık reklamı çalışmamızdı.
395 kadın babun vajinal koku örneğinin analizinden toplam 74 uçucu bileşik tespit ettik. Bunlar arasında ketonlar, alkoller, aldehitler, terpenler, uçucu yağ asitleri ve hidrokarbonlar gibi doğal olarak oluşan bir dizi kokulu uçucu bileşik vardı. Tipik kromatogramlar, doğurgan ve doğurgan olmayan dönemlerden boş trol ve dişi babun vajinal koku örneklerini karşılaştırmak için kullanılır.
Vajinal koku profilleri ile kadın babunların cinsel duyarlılığı arasındaki ilişkileri inceliyoruz. Sonuçlarımız, toplam vajinal koku miktarının doğurganlıkla farklılık gösterdiğini ve kokunun kadın babun doğurganlığının sinyalini vermede rol oynayabileceğini gösterdi. Ayrıca grup tipleri arasında vajinal koku farklılıkları bulduk, ancak grup kompozisyonunun etkilerini, kadın yaş safsızlığını ayırt edemedik.
GCMS'nin örnekleme ve kullanımının kombine avantajlarıdır. Bu nedenle, kafa boşluğu katı faz mikro ekstraksiyonu kullanılarak GCMS kullanılarak çok çeşitli numunelerin analiz edilmesine olanak tanır. Bu karmaşık işaretlerin bileşenlerini ayırabiliyoruz ve sonra kütle spektrometresini kullanarak bu bileşenlerin her birini tanımlayabiliyoruz.
Ve sonra, tüm kombine teknik çok güçlüdür ve bize bu koku işaretleri hakkında çok fazla bilgi verir, ki geçmişte sonuçları elde edebilmek için çok fazla numune hazırlama ekstraksiyonu gerekirdi.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
