Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Поколение олигодендроцитов и олигодендроцитов-кондиционированных средних для совместно-культурных экспериментов
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
В этом виде мы демонстрируем эффективный метод очистки олигодендроцитов и производства олигодендроцитов, которые могут быть использованы для совместно-культурных экспериментов.
Transcript
Мы описываем эффективный метод очищения и культуры олигодендроглиальных клеток линии. Это позволяет решать молекулярные механизмы, контролирующие дифференциацию олигодендроцитов и их взаимодействие с нейронами в процессе миелинизации. Этот метод встряхивания не является дорогостоящим и является оптимальным для получения большого количества олигодендроцитов.
Такие культуры позволяют выпроизводства олигодендроцитов состоянии среды и совместно культур олигодендроцитов с нейронами. Рассеянный склероз является заболеванием, вызванным очагом демиелинизации в центральной нервной системе, вторичным по отношению к потере олигодендроцитов. Культура олигодендроцитов обеспечивает инструмент для лучшего понимания того, как способствовать повторной миелинизации.
Только олигодендроглиальная культура клеток может дать представление о внутренних механизмах, регулирующих развитие и биологию олигодендроцитов. Со-культуры с нейронами позволяют получить представление об их воздействии на физиологию нейронов. Для начала используйте изогнутые типсы для поддержания головы животного на уровне глаз.
Используйте небольшие хирургические ножницы, чтобы сделать небольшой разрез у основания черепа и вырезать череп после средней линии мозга. Используйте типсы, чтобы аккуратно очистить две части черепа от средней линии. Используйте небольшую хирургическую ложку, чтобы удалить мозг из полости головы.
Положите мозг в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую ледяную глюкозу PBS на льду. Просмотр под стерео микроскопом, использовать тонкие миппы для удаления мозжечка, ствола мозга, и обонятельные лампы из полушарий головного мозга. Используйте тонкие типсы, чтобы отделить два полушария головного мозга.
Используйте тонкие типсы, чтобы снять менинги. Положите мозговые кортики в 60-миллиметровую чашку Петри на лед. В ламинарном капюшоне используйте острый скальпель, чтобы мелко нарезать мозговые кортисы.
Перенесите рубленую ткань в 50-миллилитровую трубку, содержащую среду пищеварения ферментов. Инкубировать в течение 30 минут во влажном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислым газом. После этого используйте пипетку, чтобы аккуратно удалить среду пищеварения фермента, убедившись, что корковая ткань остается в нижней части трубки.
Используйте микропипют P1000, чтобы добавить один миллилитр DMEM 10%fetal икроножной сыворотки и аккуратно тритурировать ткани. Используйте 70-микрон-фильтр и поршень одного миллилитрового шприца для фильтрации корковой ткани в 50-миллилитровую трубку. Промыть остаточную ткань на внутренней стенке трубки 50-миллилитровой трубки несколько раз с DMEM 10%fetal теленка сыворотки.
Заполните 50-миллилитровую трубку сывороткой DMEM 10%fetal calf. Центрифуга при 423 раза г в течение пяти минут при комнатной температуре. Аккуратно удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы двумя миллилитров сыворотки DMEM 10%fetal calf.
Аккуратно тритурировать клеточные гранулы с помощью микропипетта P1000, а затем, с помощью микропипеда P200. Разбавить клеточной суспензией с соответствующим объемом DMEM 10%fetal икроножной сыворотки. Плита пять миллилитров клеточной подвески на колбе Т-150 при плотности от 1 раза от 10 до пятой клетки на квадратный сантиметр.
Добавьте 20 миллилитров теплой сыворотки для теленка DMEM 10%fetal в каждую колбу Т-150. Инкубация во влажном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислым газом. После встряхивания образца на ночь при 250 об/мин и 37 градусов по Цельсию, урожай супернатанта в колбе, содержащей в основном олигодендроцитов линии клеток, но и, некоторые микроглиальные клетки, и пластины его на не покрытой покрытием 100-миллиметровые чашки Петри.
Инкубировать чашки Петри в течение 15 минут во влажном инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе. Это позволяет удалить микроглиальные клетки через дифференциальную быструю адгезию на поверхности тарелки. В то же время, заполнить каждый Т-150 колбу с 25 миллилитров теплой, свежеприготовленной культуры среды и инкубировать во влажном инкубаторе при 37 градусов по Цельсию под 5%углекислого газа до второй тряски.
Затем перенесите супернатант из чаши Петри в новые 100-миллиметровые чашки Петри, не покрытые покрытием, чтобы позволить ссадить остаточные микроглиальные клетки. Инкубировать чашки Петри в течение 15 минут во влажном инкубаторе при 37 по Цельсию под 5%углекислого газа. Удалите супернатант из каждых двух блюд Петри, которые содержат непритятарные клетки линии олигодендроцитов, и перенесите его в 50-миллилитровую трубку.
Откажитесь от блюд Петри, помояемых микроглией. Центрифуга труб в течение пяти минут при 423 раза г. Аккуратно удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы одним миллилитром среды Боттенштейн-Сато.
Бассейн все гранулы в общей 50-миллилитровой трубки и настроить объем до 20 или 30 миллилитров в зависимости от плотности клеток с Bottenstein-Сато среды. Плита два или три предварительно покрытием 100-миллиметровые чашки Петри с 10 миллилитров клеточной подвески. Инкубация во влажном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислым газом.
Два часа спустя, очистить мусор от чаши Петри, освежив все Bottenstein-Сато среды. Инкубировать в течение двух дней в среде во влажном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислым газом. Через два дня изучите культуру под микроскопом.
В ламинарном капюшоне потока, в стерильных условиях, обновить культурную среду с 10 миллилитров теплой МПБ-27 низкой среды. Инкубировать в течение двух дней во влажном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислым газом. Чтобы собрать OCM, собрать супернатант, содержащий олигодендроциты выделяется факторов.
Фильтр стерилизовать OCM с помощью фильтра 0,22 микрон. В этом протоколе клетки линии олигодендроцитов были очищены от глиальных культур, стряхивая астроциты и микроглии. Анализ экспрессии различных маркеров показал, что культуры олигодендроцитов были в основном доолигодендроцитами с 90 плюс-минус 4% положительных клеток O4, 85 плюс-минус 7%NG2 положительных клеток и 4,7 плюс-минус 2,1% положительных клеток ПЛП, в то время как 7,2 плюс-минус 2,5% клеток были положительными астроцитами GFAP.
OCM производства из таких культур были добавлены в течение трех дней в пробирке для очищения гиппокампа нейронных культур. Это лечение способствует кластеризации нотальных белков. Миелинизация гиппокампа нейронов были изучены путем добавления олигодендроктии на 14 дней в пробирке.
От 20 до 24 дней in vitro, иммуноокрашивание маркеров миелина, таких как основной белок миелина, позволило визуализировать сегменты миелина и узлы Ranvier. Основной PBS имеет важное значение для удаления meninges. Быстрая очистка имеет решающее значение для жизнеспособности олигодендроки и реализации сильных сторон потока, применяемого с пипеткой.
Олигодендроцит-кондиционированной среды могут быть добавлены в нейронных культур, чтобы получить представление о влиянии олигодендроцитов секретных факторов на нейронной физиологии. Со-культуры олигодендрокти с нейронами также могут быть выполнены для изучения процесса миелинизации.
Tags
Неврология Выпуск 156 олигодендроциты условные средние выделяемые факторы клеточная культура нейро-глиа взаимодействия центральная нервная система крысаRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
