Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En anpassad Multiphoton Mikroskopi plattform för Live Imaging av Mus Hornhinna och Bindhinna
Chapters
Summary May 17th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Presenteras här är en multiphoton mikroskopisk plattform för levande mus okulär yta imaging. Fluorescerande transgen mus möjliggör visualisering av cellkärnor, cellmembran, nervfibrer och kapillärer inom den okulära ytan. Icke-linjära andra harmoniska generationen signaler som härrör från kollagenous strukturer ger etikett-fri bildbehandling för stromal arkitekturer.
Transcript
Detta protokoll använder ett multi-filter mikroskop för levande avbildning av hela strukturen av mus okulär yta i den dubbla fluorescerande transgena musmodellen. Kombinationen av en anpassad multifoton mikroskopisk plattform och dubbla fluorescerande transgena möss möjliggör realtid visualisering av och struktur okulär yta. För att ställa in multifotonmikroskopet väljer du vattenbadningen 20X, 1.00 NA-målsättningen och sätter Titansaplinlasern som excitationskälla på ett upprätt mikroskop.
Ställ in laserutgångsvåglängden till 880 nanometer för EGFP och 940 nanometer för tdTomato. Inkludera två dichroic speglar för separation av SHG EGFP och EGFP tdTomato och använda 434-17, 510-84 och 585-40 nanometer bandpassfilter för att spektralt separera SHG EGFP och tdTomato signaler. För att ställa in ögonhållaren, efter att ha bekräftat en brist på svar på pedalreflex i en sövd 8-12 veckor gammal mus, placera musen på den uppvärmda mikroskopet skede och infoga en temperatur övervakning sond.
Placera musen i en anpassad stereotaxisk mushållare och sätt i öronstänger i den externa hörselköttet. Använd tre punktfixering för att säkra huvudhållaren och applicera en 0,4%Oxybuprokain Hydroklorid och saltlösning på okulärytan. Täck spetsarna på ett par nummer fem Dumont-forceps med PE-rörslingan.
Efter tre minuter utföra en manuell ögonlocket upprullning för att bekräfta ögongloben utsprång och försiktigt placera en PE innehavaren röret slinga längs ögonlocket marginalen för att exponera okulär yta. Och använd knoppen av hållaren för att stabilisera ögongloben med tentarna. Sedan, täcka hornhinnans yta med ett öga gel med ett brytningsindex på 1,338.
För Z-seriebilder av hornhinneytan, använd en kvicksilverljuskälla för att avbilda målfältet och öppna mikroskopmjukvaran. Välj lämplig fotomultiplikator och digitala vinster för visualisering av cellstruktur i den okulär yta och ställa in den första och sista bilden för att tillåta förvärv av en bildstapel. Ställ in bildupplösningen på 512 med 512 pixlar och Z-steget till en mikrometer.
Klicka sedan på Start för att samla in Z-seriebilder som skaffar en livebild med en 880 nanometerexcitation för SHG EGFP-signalsamling, och en livebild vid en 940 nanometerexcitation för EGFP tdTomato-signalinsamling inom varje område. Under hela bilden, använd stege motoriserade steghållare för att rotera ögongloben för att möjliggöra bildbehandling över hela hornhinnans yta. När alla bilder har förvärvats, ladda Z-seriens bilder i Fiji och välj Median 3D-filter plugin.
När du har tagit bort bakgrundsbruset väljer du filterpaketet för oskarp mask Fiji för att skärpa bilderna och klicka på automatisk ljusstyrka kontrast för att automatiskt optimera kvaliteten på bilderna. Efter bearbetning, spara bilderna som en seriell bildsekvens och exportera bildsekvensen i en lämplig 3D återuppbyggnadsprogram. I alla multiphoton mikroskopi bilder, presentera EGFP tdTomato och SHG signaler i pseudo grön, röd och cyan respektive innan fånga 3D-struktur bilder genom ögonblicksbild.
Multiphoton mikroskopi möjliggör visualisering av ytliga Wing och Basala celler i hornhinnans epitel av dubbla fluorescerande transgena möss. Enstaka celler från basalskiktet kan mappas till det ytliga skiktet samt enstaka sexkantiga formade ytliga celler. Som avslöjas av cytoplasmatiska uttryck för tdTomato signalen, är membranet protein rika intracellulära vesicular systemet, inklusive golgi apparaten och endoplasmic reticulum utspridda inom vingcellerna.
Inom kollagen stroma, stellate formade coratesites beskrivs av membranet inriktning EGFP lysrör i dessa möss. De coratesites inbäddade i collegen stroma är mer löst fördelade än inom endotelceller. Dessutom kan tunna förgrenande nerver inom hornhinnan stroma också visualiseras genom membran inriktning tdTomato signaler och hornhinnans endotel cell monolayers visa en relativt homogent sexkantiga formen ansluten i ett honeycombed mönster.
Limbalepitelet består av ett till två lager epitelceller. Den dubbla fluorescerande reportern transgen stam möjliggör också avbildning av kapillärer inom bindhinnan, vilket underlättar återuppbyggnaden av 3D-arkitekturen i kapillärerna som beskriver det vaskulära endotelet. Stabilisera ögongloben med måttligt tryck utan skada är avgörande för att förvärva god kvalitet bilder som otillräcklig eller överdriven tryck kan äventyra bildkvaliteten.
Denna NVivo bild imaging plattform kan ändras för visualisering av strukturer under den okulära ytan och kan tillämpas på in-situ studier av olika oftalmiska sjukdomar.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
