Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En neurite utvekstanalyse og nevrotoksisitetsvurdering med humane nevrale stamcelleavledede nevroner
Summary August 6th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Den presenterte protokollen beskriver en metode for en neurite utvekstanalyse og nevrotoksisitetsvurdering av små molekylforbindelser.
Transcript
Den presenterte protokollen som beskriver neuritt utvekstanalyse som er svært relevant for menneskelig biologi og nevrotoksisitetsvurdering av et lite molekylforbindelser. Høyt translasjonelt potensial og fysiologisk relevans av humane nevrale stamceller som den primære menneskelige cellemodellen gir en betydelig fordel i neuritt utvekstrelatert narkotikaoppdagelsesscreening og nevrotoksisitetsvurdering. Ved hjelp av den presenterte protokollen kan menneskelige induserte pluripotente stamceller og humane embryonale stamcelleavledede nevroner også brukes som alternative cellekilder for neurittvekstanalysen og nevrotoksisitetsvurderingen.
Begynn med å samle media med flytende nevrosfærer og overføre det til et 50 milliliter konisk rør. Sentrifuger røret på 300 til 400 ganger g i tre minutter. Deretter forsiktig aspirere supernatant.
og resuspend kulene i 500 mikroliter av tint celle dissosiasjon reagens. Inkuber kulene ved 37 grader Celsius i fem til 15 minutter. Tilsett deretter fem til 10 milliliter med forvarmede kulturmedier og sentrifuger røret på 300 til 400 ganger g i fem minutter for å sedimentere nevrosfærene.
Aspirer supernatanten og legg til to milliliter kulturelle medier som pipetter opp og ned med en 1000 mikroliter pipette til neurosfærene danner en enkelt cellesuspensjon. Etter å ha talt cellene, legg til to til 3 millioner celler til en T25 kolbe i 10 milliliter kulturmedier. Bytt ut halvparten av kulturmediene hver tredje dag.
Bruk kommersielt tilgjengelig kryopreservasjonsmedium for å fryse cellene. Overfør nevrosfærene til et 50 milliliter rør og la kulene bosette seg nederst. Bruk en 200 eller 1000 mikroliter pipettespiss til å overføre de store nevrosfærene til et nytt 50 milliliter rør før passaging.
Sentrifuge de resterende nevrosfærene på 300 til 400 ganger g i tre minutter og fjern forsiktig overnatanten. Resuspend opp til tusen kuler i en milliliter kryopreservation reagens og overføre den til en cryo tube. Oppbevar røret over natten ved minus 80 grader Celsius, og flytt det deretter til flytende nitrogen for langsiktig lagring.
Hvis du vil måle nevronal utvekst, åpner du bildet i Fiji og velger Analyser, Verktøy og ROI Manager. Høyreklikk på det femte ikonet i verktøylinjen Rett og bytt til Freehand Line. Du kan eventuelt dobbeltklikke på det samme ikonet for å endre linjebredden til 10.
Deretter sporer du den lengste neuritten som begynner nær cellekroppen og strekker seg til spissen. Trykk på Kontroll og T deretter F for å legge til målingen i ROI Manager og markere den målte nevronen. Velg alle tallene i avkastningen.
Klikk på Mål, og kopier og lim deretter inn målene i et regneark. For å måle fluorescensintensiteten til merkede celler, klikk på det fjerde ikonet på verktøylinjen Frihåndsvalg og tegn formen på cellen. Klikk analyser og angi målinger.
Kontroller deretter at Område, Gjennomsnitt grå verdi, Min maks grå verdi og Integrert tetthet er valgt. Klikk analyser og mål. Merk området ved siden av cellen som bakgrunn.
Og klikk deretter analyser og mål. Velg alle måledata og kopier, lim den inn i et regneark. For å belegge platen tilsett 30 mikroliter poly-L-lysin i hver brønn av en 384-brønns plate og inkubere platen ved romtemperatur i en time.
Vask den to ganger med PBS og la den tørke i ca. 30 minutter. Tilsett 30 mikroliter laminine til hver brønn, og inkuber deretter platen ved 37 grader Celsius i to timer. Gjenta vaskene med PBS og fortsett med plating cellene.
Tilsett 20 000 encellede nevrosfærer i 25 mikroliter differensieringsmedier til hver brønn av 384-brønnplaten og inkuber platen ved 37 grader Celsius i fem dager. Hight presisjon pipettering ferdigheter er nødvendig for plating det nøyaktige antall neurosfærer som er alle segregert i enkeltceller. Derfor differensierer neurosfærene i nevroner før plating anbefales for å oppnå mer reproduserbare resultater.
Etter inkubasjonen, tilsett fem mikroliter av testforbindelse til hver brønn på seks ganger ønsket konsentrasjon. Og inkuber cellene i ytterligere 24 timer. For å utføre celle levedyktighet essay, legg til 30 mikroliter av selvlysende reagens til hver brønn.
Og la platen stå på en shaker i to minutter. Sentrifuger platen ved 300 til 400 ganger g i 30 sekunder, og inkuber deretter platen ved romtemperatur i 10 minutter, og beskytt den mot lys. Etter inkubasjonen måler du lysstyrken på en mikroplateleser.
De menneskelige nevrale stamcelleavledede nevronene ble brukt til å undersøke effekten av HDAC-hemmere som små molekylepigene forbindelser for forlengelse av nevritt og påfølgende nevrogen evne til små molekylforbindelser. Nevrotoksisiteten til HDAC-hemmere ble også vurdert etter differensiering av nevrale stamceller i 384-brønnplater, som viser potensialet til å skalere protokollen for et høyere antall forbindelser. I en annen studie ble måling av den nevronale cellefluorescensintensiteten brukt til å kvantifisere overfloden av histone H4 lysin fem acetylering som en histonemarkør etter behandling av nevronene med epigenetiske modifikatorforbindelser.
I tillegg har denne protokollen blitt brukt til å visualisere et pre-synaptisk protein, synaptofysin, for å se etter mulige synaptogene effekter av små molekylforbindelser. Ved hjelp av den presenterte metoden kan neurittnummer, intensitet, lengde og bredde, sammen med synaptiske egenskaper, inkludert pre- og postsynaptiske proteinmodifikasjoner måles pålitelig.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
