Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En Neurite Utväxt analys och neurotoxicitet bedömning med mänskliga neurala stamceller cell-härledda nervceller
Summary August 6th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Det presenterade protokollet beskriver en metod för en neurite utväxt analys och neurotoxicitet bedömning av små molekylföreningar.
Transcript
Det presenterade protokollet som beskriver neurit utväxt assay som är mycket relevant för mänskliga biologi och neurotoxicitet bedömning av en liten molekyl föreningar. Hög translationell potential och fysiologiska relevans av mänskliga neurala stamceller som den primära mänskliga cellmodellen erbjuder en avsevärd fördel i neurite utväxt-relaterade narkotika discovery screening och neurotoxicitet bedömning. Utnyttja den presenterade protokollet, mänskliga inducerad pluripotenta stamceller och mänskliga embryonala stamceller-härledda nervceller kan också användas som till alternativa cell källor för neurite utväxt assay och neurotoxicitet bedömning.
Börja med att samla media med flytande neurosfärer och överföra den till en 50 milliliter konisk rör. Centrifugera röret vid 300 till 400 gånger g i tre minuter. Därefter aspirera försiktigt supernatanten.
och resuspend sfärerna i 500 mikroliter av avfrostad cell dissociation reagens. Inkubera sfärerna i 37 grader Celsius i fem till 15 minuter. Tillsätt sedan fem till 10 milliliter förvuppvade odlingsmedier och centrifug röret på 300 till 400 gånger g i fem minuter för att sedimentera neurosfärerna.
Aspirera supernatanten och tillsätt två milliliter av kulturella medier pipettering upp och ner med en 1000 microliter pipetter tills neurosfärerna bildar en enda cell suspension. Efter att ha räknat cellerna, tillsätt två till 3 miljoner celler till en T25 kolv i 10 milliliter av kulturmedier. Byt ut hälften av kulturmedierna var tredje dag.
Använd kommersiellt tillgängliga cryopreservation medium för att frysa cellerna. Överför neurosfärerna till ett 50 milliliterrör och låt sfärerna bosätta sig i botten. Använd en 200 eller 1000 mikroliterpipett för att överföra de stora neurosfärerna till ett nytt 50 milliliterrör innan du passarging.
Centrifugera de återstående neurospheres på 300 till 400 gånger g i tre minuter och försiktigt ta bort supernatanten. Resuspend upp till tusen sfärer i en milliliter av kryokonservering reagens och överföra den till en cryo rör. Förvara röret över natten på minus 80 grader Celsius, sedan flytta den till flytande kväve för långsiktig lagring.
För att mäta neuronal utväxt, öppna bilden i Fiji och välj Analysera, Verktyg och ROI Manager. Högerklicka på den femte ikonen i verktygsfältet Straight och byt till Freehand Line. Tillval dubbelklickar du på samma ikon för att ändra linjebredden till 10.
Sedan spåra den längsta neurite början nära cellkroppen och sträcker sig till spetsen. Tryck control och T sedan F för att lägga till mätningen till ROI Manager och markera den uppmätta neuronen. Markera alla nummer i avkastningen på investeringen.
Klicka på Mät, sedan kopiera och klistra in mätningarna i ett kalkylblad. För att mäta fluorescensintensiteten hos märkta celler klickar du på den fjärde ikonen i verktygsfältet Freehand Selections och ritar cellens form. Klicka på Analysera och ange mått.
Se sedan till att Område, Medelvärdet av grått värde, Min max gråvärde och Integrerad densitet är markerade. Klicka på Analysera och mät. Markera regionen bredvid cellen som bakgrund.
Och klicka sedan på analysera och mäta. Markera alla mäta data och kopiera, klistra in den i ett kalkylblad. Att belägga plattan lägga 30 mikroliter av poly-L-lysin i varje brunn av en 384-brunnsplatta och inkubera plattan vid rumstemperatur i en timme.
Tvätta den två gånger med PBS och låt den torka i cirka 30 minuter. Tillsätt 30 mikroliter laminine till varje brunn, sedan inkubera plattan vid 37 grader Celsius i två timmar. Upprepa tvättarna med PBS och fortsätt med att plätering cellerna.
Lägg till 20, 000 single cell neurospheres i 25 mikroliter av differentiering media till varje brunn av 384-brunnen plattan och inkubera plattan på 37 grader Celsius i fem dagar. Hight precision pipettering färdigheter krävs för plätering det exakta antalet neurosfärer som är alla segregerade i enstaka celler. Därför, differentiering av neurosfärerna till nervceller innan plätering rekommenderas för att uppnå mer reproducerbara resultat.
Tillsätt efter inkubationen fem mikroliter av testmassa till varje brunn vid sex gånger den önskade koncentrationen. Och inkubera cellerna i ett dygn till. För att utföra cellen livskraft uppsats, tillsätt 30 mikroliter av luminescent reagens till varje brunn.
Och låt plattan på en shaker i två minuter. Centrifugera plattan vid 300 till 400 gånger g i 30 sekunder, sedan inkubera plattan i rumstemperatur i 10 minuter, skydda den från ljus. Efter inkubationen mäter du luminesen på en mikroplattläsare.
Den mänskliga neurala progenitor cell-derived nervceller användes för att undersöka effekten av HDAC-hämmare som liten molekyl epigenic föreningar för förlängning av neuriter och efterföljande neurogena förmåga små molekyler föreningar. Neurotoxiciteten hos HDAC-hämmarna bedömdes också efter differentieringen av de neurala stamcellerna i 384-brunnsplattor, vilket visar potentialen att skala protokollet för ett högre antal föreningar. I en annan studie, mätning av neuronal cellen fluorescens intensitet användes för att kvantifiera överflödet av histon H4 lysin fem acetylation som en histon markör efter behandling av nervceller med epigenetiska modifiera föreningar.
Dessutom, Detta protokoll har använts för att visualisera en pre-synaptiska protein, synaptophysin, att kontrollera för eventuella synaptogena effekter av små molekyler föreningar. Med hjälp av den presenterade metoden kunde neurittal, intensitet, längd och bredd, tillsammans med synaptiska egenskaper, inklusive modifieringar av pre- och eftersynaptiska proteiner mätas på ett tillförlitligt sätt.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
