Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Voorbereiding van Drosophila Larval en Pupal Testes voor analyse van celafdeling in levend, intact weefsel
Chapters
Summary May 19th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Het doel van dit protocol is om celdeling in intact weefsel te analyseren door levende en vaste celmicroscopie met drosophila meiotic spermatocyten. Het protocol laat zien hoe hele, intacte teelballen van Drosophila larven en vroege poppen te isoleren, en hoe ze te verwerken en te monteren voor microscopie.
Transcript
Dit protocol kan worden gebruikt om de mechanismen van celdeling te analyseren in de context van het leven, intact weefsel met behulp van fluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de oorspronkelijke fysiologische omgevingen van cellen behouden blijven, terwijl ze ook live beeldvorming over lange tijdscursussen mogelijk maken. Het belangrijkste onderdeel van deze techniek is ervoor te zorgen dat de teelballen niet beschadigd raken tijdens dissectie of montage.
Dit is een vaardigheid die wordt verworven met een beetje tijd en praktijk. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, omdat het laat zien hoe de teelballen te identificeren en te isoleren, en hoe ze te monteren voor beeldvorming zonder beschadiging van het weefsel. Bereid dieren, gereedschappen en media voor zoals beschreven in het manuscript.
Voordat u met de dissectie begint, gebruikt u de met de media gevulde filterspuit om drie druppels media te verdrijven die elk 50 microliter aan de bovenkant, het midden en de onderkant van een glazen schuif hebben. Met behulp van een ontledende sonde, breng vijf tot 10 derde instar larven of vroege poppen naar de bovenste druppel van de media op de dia. Roer de larven en poppen in de media voorzichtig met de ontledende sonde om voedsel of vuil te verwijderen.
Gebruik de ontleedsonde om een enkele larven of poppen op zijn kant te draaien. Kijk voor de twee bilaterale teelballen die verschijnen als doorschijnende ovale structuren op het achterste derde van het lichaam. Dieren die geen teelballen hebben, zijn vrouwelijk en moeten worden weggegooid.
Wanneer een mannelijke larven of poppen wordt gevonden en schoon is, verplaats het naar de tweede druppel media. Herhaal dit totdat drie of vier mannelijke larven of poppen zijn overgebracht naar de tweede druppel media. Dan werken in de tweede druppel van de media, pak een enkel dier met een paar tangen in het midden van de regio, net voor de teelballen.
Gebruik een tweede paar tangen om het dier voorzichtig doormidden te scheuren. Met behulp van een paar tangen, houd het achterste uiteinde van het dier naar beneden op de glazen glijbaan. Vanaf net naast de tang, duw naar beneden op de cuticula met behulp van de rand van de scalpel.
Beweeg de scalpel naar het snijkant van het dier. Dit zal verdrijven van het dier inwendige organen, waaronder de darmen, vet lichamen, en teelballen. De teelballen zijn kleurloos en bijna transparante ovale organen ingebed in linten van vet lichaam.
Voorzichtig plagen uit elkaar de teelballen van de rest van de organen. Om de teelballen één voor één over te brengen, steek je de rand van de scalpel onder het vetlichaam in, til je het weefsel uit de media en verplaats het snel naar de derde druppel. Als er nog niet genoeg vet lichaam nog steeds bevestigd aan de teelballen om het weefsel op te heffen met de scalpel gebruik maken van een glas Pasteur pipet die is voorbedacht met dissectie medium.
Werken in de derde druppel van medium, gebruik maken van de scherpe kant van de scalpel om voorzichtig weg te snijden overtollig vet lichaam van de teelballen, waardoor slechts een kleine rand van vet lichaam rond de randen. Gebruik eerst de filterspuit om een enkele druppel van Schneiders medium ongeveer 30 microliters op het midden van een 50 millimeter gaspermeabele kweekschaal te deponeren. Met behulp van de scalpel tool of een vooraf geteste Pasteur pipet overdracht tot vijf van de bereide teelballen aan de druppel op de schotel.
Gebruik vervolgens het scalpelgereedschap om de teelballen voorzichtig op het gaspermeesbare membraan en in het midden van de druppel medium te duwen. Met behulp van een een milliliter spuit, plaats vier druppels halocarbon olie op het gas doorlatend membraan rond de druppel van medium. De plaatsen van de druppels moeten overeenkomen met de vier hoeken van een 22 millimeter klasse coverslip.
Dan lijn de hoeken van een 22 millimeter glazen coverslip met de vier druppels halocarbon olie en zachtjes lager de coverslip op de media en olie. Laat de coverslip te regelen, en voor de media met de teelballen de verspreiding tussen de druppels olie. Plaats het kweekgerecht onder een ontledende microscoop.
Als u overtollige media wilt verwijderen, plaatst u de hoek van een delicate taakdwgen onder de omdekplaat. Wick weg genoeg media voor de glazen coverslip om gewoon contact te maken met het oppervlak van de grootste testis. Verwijder niet te veel media en laat de coverslip te ver zakken.
Dit zal druk uitoefenen op de teelballen en kan ervoor zorgen dat ze scheuren. Tot slot, plaats een druppel onderdompeling olie op de glazen coverslip net boven de teelballen. Draai de schotel, en leg het op de microscoop podium.
Verplaats de 40 of 60 X microscoop doelstelling in de olie totdat het net onder de teelballen. Gebruik uitgezonden licht om een enkele testis te vinden en in beeld te brengen. Plaats 0,5 milliliter van 8% paraformaldehyde in PBSTx in een put van een negen goed ontleden schotel.
Gebruik een glazen Pasteur pipet om tot 10 van de teelballen naar de put over te brengen. Zorg ervoor dat de teelballen op de bodem van de put liggen. Breng de teelballen na 20 minuten over naar een put met 0,5 milliliter PBSTx.
Was de teelballen door vijf minuten zachtjes te roeren. Was nog twee keer in nieuwe putten met verse PBSTx. Bereid een verdunning van het primaire antilichaam in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis zoals beschreven in het manuscript.
Breng vervolgens de teelballen van de negen goed glazen ontleden schotel naar de buis. Incubeer de buis 's nachts op vier graden Celsius met zachte schommelen of nutatie. De procedure voor het beitsen van de teelballen met het secundaire antilichaam is vergelijkbaar.
Zie het manuscript voor meer informatie. Breng eerst met behulp van een Pasteur pipet de teelballen van de negen putplaat over op een glazen microscopieschaar. Gebruik indien nodig de rand van de scalpel om de teelballen op het oppervlak van de dia te duwen.
Gebruik vervolgens de hoek van een delicate taak af te vegen om overtollige vloeistof van de teelballen af te voeren. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof. Breng vervolgens een 30 tot 50 microliter druppel microscopie montagemedium aan op de teelballen.
Tot slot, plaats een 22 millimeter coverslip op de druppel van montage medium. Laat de coverslip te regelen, en de montage medium te verspreiden onder de coverslip. Breng indien nodig een zachte druk uit op de afdekken om overtollig montagemedium uit te persen en laat de afdekken op het oppervlak van de teelballen rusten.
Wanneer dit protocol met succes wordt uitgevoerd, blijft de cellulaire organisatie van de teelballen behouden en is de progressie van celdifferentiatie van het ene uiteinde van de testis naar het andere zichtbaar. Spermatocyten op het punt om te beginnen meiose en die in metafase kan worden geïdentificeerd. In teelballen die met behulp van dit protocol worden voorbereid, toont live beeldvormingsanalyse de dynamische reorganisatie van het endoplasmatische reticulum en microbuisjes bij het verdelen van spermatocyten.
Zoals beschreven in het protocol, moet grote zorg worden genomen om geen druk uit te oefenen die ervoor zorgt dat de teelballen barsten. Cysten van spermatocyten stromen snel uit een gescheurde testis, waardoor live time lapse imaging moeilijk is. Dit protocol is geoptimaliseerd voor beeldvorming die spermatocyten in levend, intact weefsel verdeelt.
Daarom is het essentieel dat de teelballen niet beschadigd raken tijdens dissectie of montage. Onze methode moet ook geschikt zijn voor beeldvormingstechnieken met superresolutie, zoals gestructureerde verlichtingsmicroscopie, die nieuwe inzichten bieden in dynamische subcellulaire processen die de celdeling regelen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
