Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Баллистическая маркировка пирамидальных нейронов в мозговых фрагментах и в первичной культуре клеток
Chapters
Summary April 2nd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Мы представляем протокол для обозначения и анализа пирамидальных нейронов, что имеет решающее значение для оценки потенциальных морфологических изменений в нейронах и дендритных позвоночниках, которые могут лежать в основе нейрохимических и поведенческих аномалий.
Transcript
Этот протокол позволяет оценить потенциальные морфологические изменения в нейронах и дендритных шипах, которые могут подчеркивать нейрохимические и поведенческие отклонения. Он уникален и полезен для визуализации нейронов в различных областях мозга у крыс, что в сочетании со сложным программным обеспечением реконструкции позволяет исследователям прояснить возможные механизмы, лежащие в основе нейрокогнитивной дисфункции. Начните с подготовки решения PVP в соответствии с рукописными указаниями.
Заполните трубки с PVP и оставить его на 20 минут. И изгнать его через другой конец с 10 миллилитров шприц. Смешайте 170 миллиграммов вольфрама микрокарьерных бусин с 250 микролитров хлорида метилена.
Затем тщательно вихрем подвески. Затем добавьте 6 миллиграммов липофильной DilC18(3)красителя в 300 микролитров хлорида метилена и вихря. Трубы 250 микролитров вольфрама шарик подвески на стеклянную горку.
Подождите, пока подвеска высохнет и добавьте 300 микролитров раствора красителя. После того, как сушеные, использовать бритву, чтобы разделить смесь на две 1,5 миллилитров центрифуги труб и заполнить трубки с водой. Sonicate смесь в водяной бане до однородной.
Убедившись, что наконечник sonicator лежит непосредственно на трубах. Смешайте две смеси в 15 миллилитров конической трубки. И sonicate еще на три минуты, убедившись, что не большие сгустки красителя покрытием бисера остаются.
После sonication, нарисуйте смесь в PVP покрытием трубки с 10 миллилитров шприц. И кормить трубки в подготовительной станции. Поверните трубку на одну минуту.
Аккуратно удалите всю воду с помощью шприца. Включите азотный газ и отрегулируйте поток азота примерно до 0,5 литра в минуту. Поверните трубку на станции подготовки и высушите ее азотом в течение 30 минут.
Снимите трубку со станции и разрежьте ее на 13-миллиметровые сегменты трубчатым резаком. Убедитесь, что крыса не реагирует на вредные раздражители и рефлексы отсутствуют. Затем закрепню его в положении на спине.
Сделайте разрез вдоль грудной линии. Разделим диафрагму и открой грудь ножницами. Затем вставьте 20 калибровочных 25 миллиметров иглы в левый желудочек.
Немедленно вырежьте правый атриум ножницами и прополка 15 миллилитров 100 миллимолейных PBS с 5 миллиметрами в минуту скорости потока. Затем пронизыть 100 миллилитров 4%PFA буфера в PBS. После перфузии, удалить весь мозг крысы.
И постфикс его с 4%PFA в течение 10 минут. Используйте матрицу мозга крысы, чтобы сократить 500 микрометров толщиной корональной секции. Сделать кулак вырезать и держать лезвие на месте.
Затем сделайте второй разрез вторым лезвием и вертикально удалите первое лезвие, удерживая ткань на поверхности лезвия. Поместите ломтики мозга в 24-хорошо пластины с 1 миллилитр PBS в каждом хорошо. И повторяйте процесс до тех пор, пока все ломтики не будут разрезаны.
Удалите PBS из каждого целевого хорошо. Загрузите хрящ куском тюбинга Dil/tungsten и поместите его в аппликатор. Положите лист фильтровальной бумаги между двумя сетчатыми экранами.
И подключите аппликатор к гелиевому шлангу. Затем отрегулируйте выходной у давления гелия до 90 фунтов на квадратный дюйм. Поместите аппликатор вертикально по центру целевого хорошо 1,5 сантиметра между образцом и сетчатым экраном.
Затем огонь Dil / вольфрама трубки. Загрузите хрящ с следующей трубки и непрерывно огонь бисера из труб на оставшиеся ломтики. Заполните 24-хорошо пластины с 100 миллимолярд PBS.
И мыть ломтики три раза с 500 микролитров свежих PBS. Убедившись, что ломтики не перевернуть во время мытья. После завершения, добавить 500 микролитров свежих PBS к ломтикам.
И инкубировать их в течение трех часов при четырех градусах по Цельсию в темноте. После инкубации используйте тонкую кисть для переноса ломтиков мозга на стеклянные горки. И сразу же добавить один миллилитр антифада монтажа среды для каждого раздела.
Поместите 22 на 15 миллиметров крышки над секциями и высушите горки в темноте. Включите систему конфокального микроскопа и переключитесь на цель 60X. Отрегулируйте настройки изображения в соответствии с рукописными указаниями.
И получить изображения для целевого типа нейронов на основе границ области мозга и морфологических характеристик нейронов. Изолировать первичный корковой нейрон от F344/N крыс в послеродовой день один и культуры их в 35 миллиметров стекла нижней блюдо в течение одной недели. Освежает половину среды на третий день после изоляции.
Вымойте блюдо дважды с 1 миллилитр 100 миллимолярный PBS. И исправить клетки с 4%PFA в течение 15 минут при комнатной температуре. Баллистически обозначить клетки, как описано ранее.
И мыть их еще три раза с 1 миллилитр PBS. Добавьте 500 микролитров PBS в клетки и инкубировать их в течение трех часов при четырех градусах Цельсия в темноте. Затем добавьте 200 микролитров антифадной крепления среды.
И получить изображения для каждого целевого нейрона. Типичные пирамидальные нейроны в области гиппокампа в секциях мозга крыс были идентифицированы с помощью технологии баллистической маркировки, характеризующейся одним большим апическим дендритом и несколькими меньшими базальными дендритами вокруг сомы. Программное обеспечение количественного анализа нейронной реконструкции использовалось для отслеживания дендритных ветвей и обнаружения шипов.
Впоследствии, программное обеспечение было использовано для оценки дендритных ветвлений сложности и нейрональной сложности беседки. Морфологические изменения в дендритных шипах оценивались с использованием длины, объема и диаметра головы. Затем шипы были классифицированы на тонкие, коренастые и грибные шипы.
И была изучена относительная частота количества шипов между каждым радиусом. Более того, метод баллистической маркировки был проверен на первичном пирамидавом нейроне в клеточной культуре. Пирамидальные нейроны были определены на основе формы треугольника сомы и большого апического дендрита.
Затем программное обеспечение для реконструкции нейронов было использовано для анализа распределения тонких дендритных шипов и длины дендритного позвоночника. При попытке этого протокола, важно, чтобы избежать больших скоплений или кластеров баллистического красителя покрытием вольфрама бусы начала подготовки. Clumps не позволит различать отдельные нейроны.
В сочетании с программным обеспечением для реконструкции нейронов этот метод позволяет исследовать нейронную и дендритную морфологию позвоночника в гиппокампе пирамидальных нейронов. Программное обеспечение для реконструкции нейронов использует алгоритм, чтобы предложить автоматическую классификацию дендритных шипов. Количественная оценка нескольких параметров нейронов дает возможность лучше понять механизм, лежащий в основе когнитивной дисфункции нейронов.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
