Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Ballistisk märkning av pyramidal neuroner i hjärnan skivor och i primär cell kultur
Chapters
Summary April 2nd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi presenterar ett protokoll för att märka och analysera pyramidala nervceller, som är avgörande för att utvärdera potentiella morfologiska förändringar i nervceller och dendritiska ryggar som kan ligga till grund för neurokemiska och beteendemässiga avvikelser.
Transcript
Detta protokoll gör det möjligt att utvärdera potentiella morfologiska förändringar i nervceller och dendritic spines som kan understryka neurokemiska och beteendemässiga avvikelser. Det är unikt och användbart för att visualisera nervceller i olika hjärnregioner hos råttor, vilket i kombination med sofistikerad återuppbyggnadsprogram gör det möjligt för forskare att belysa de möjliga mekanismerna bakom neurokognitiv dysfunktion. Börja med att förbereda PVP-lösning enligt manuskriptriktningar.
Fyll slangen med PVP och låt den vara i 20 minuter. Och driva ut den genom andra änden med en 10 milliliter spruta. Kombinera 170 milligram volfram microcarrier pärlor med 250 mikroliter metylenklorid.
Sedan noggrant virvel suspensionen. Därefter lägger du till 6 milligram lipofila DilC18(3)färgämne till 300 mikroliter metylenklorid och virvel. Pipet 250 mikroliter av volfram pärlan suspensionen på ett glas slide.
Vänta tills fjädringen lufttorka och tillsätt 300 mikroliter av färgämneslösningen. När torkat, använd en rakhyvel för att dela blandningen i två 1,5 milliliter centrifugrör och fyll rören med vatten. Sonikera blandningen i ett vattenbad tills homogen.
Se till att sonicator spetsen ligger direkt på rören. Kombinera de två blandningarna i en 15 milliliter konisk rör. Och sonikera i ytterligare tre minuter, se till att inga stora klumpar av färgbelagda pärlor kvar.
Efter ultraljudsbehandling, dra blandningen i PVP belagda slangar med en 10 milliliter spruta. Och mata in slangen i förberedelsestationen. Rotera slangen i en minut.
Ta försiktigt bort allt vatten med hjälp av en spruta. Sätt på kvävegasen och justera kväveflödet till cirka 0,5 liter per minut. Rotera slangen i beredningsstationen och torka den med kvävgas i 30 minuter.
Ta bort slangen från stationen och skär den i 13 millimeter segment med en slangskärare. Se till att råttan inte är lyhörd för skadliga stimuli och reflexer är frånvarande. Sedan säkra den i ryggläge.
Gör ett snitt längs bröstkorgens mittlinje. Separera membranet och öppna bröstet med sax. Sätt sedan in en 20 gauge 25 millimeters nål i den vänstra ventrikeln.
Skär omedelbart höger förmak med sax och granska 15 milliliter på 100 millimolar PBS med en 5 millimeter per minut flödeshastighet. Sedan granska 100 milliliter av 4%PFA buffrade i PBS. Efter perfusion, ta bort hela råtthjärnan.
Och postfix det med 4%PFA i 10 minuter. Använd en rat brain matris för att skära 500 mikrometer tjock koronasektion. Gör en knytnäve klippa och hålla bladet på plats.
Gör sedan ett andra snitt med ett andra blad och vertikalt ta bort det första bladet, hålla vävnaden på bladytan. Placera hjärnan skivor i 24-brunnsplattan med 1 milliliter PBS i varje brunn. Och upprepa processen tills alla skivor har skurits.
Ta bort PBS från varje riktad brunn. Ladda brosket med bit Dil / volfram slangar och placera den i applikatorn. Lägg en bit filterpapper mellan de två nätskärmarna.
Och koppla applikatorn till heliumslangen. Justera sedan utgående trycket av helium till 90 pounds per kvadrattum. Placera applikatorn vertikalt på mitten av den riktade väl 1,5 centimeter mellan provet och nätskärmen.
Avfyra sedan Dil/volframslangen. Ladda brosket med nästa slangar och kontinuerligt eld pärlorna från slangarna på de återstående skivorna. Fyll 24-brunnsplattan med 100 millimolar PBS.
Och tvätta skivorna tre gånger med 500 mikroliter färska PBS. Se till att skivorna inte vänds över under tvätten. När du är klar, tillsätt 500 mikroliter färska PBS till skivorna.
Och inkubera dem i tre timmar vid fyra grader Celsius i mörkret. Efter inkubationen, använd en fin borste för att överföra hjärnan skivor på glas diabilder. Och omedelbart lägga till en milliliter av antifade monteringsmedium till varje sektion.
Placera en 22 och 15 millimeter coverslip över sektionerna och torka diabilder i mörkret. Slå på confocal mikroskop systemet och byta till en 60X mål. Justera bildframställningsinställningarna enligt manuskriptriktningar.
Och få Z-stack bilder för den riktade neuron typ baserat på hjärnans region gränser och morfologiska egenskaper av nervceller. Isolera primära när neuron från F344/N råttor vid postnatal dag ett och kultur dem i en 35 millimeter glas botten skålen för en vecka. Uppfriskande hälften av mediet på den tredje dagen efter isolering.
Tvätta skålen två gånger med 1 milliliter på 100 millimolar PBS. Och fixa cellerna med 4%PFA i 15 minuter vid rumstemperatur. Ballistiskt märka cellerna som tidigare beskrivits.
Och tvätta dem tre gånger till med 1 milliliter PBS. Tillsätt 500 mikroliter PBS till cellerna och inkubera dem i tre timmar i fyra grader Celsius i mörkret. Tillsätt sedan 200 mikroliter av antifade monteringsmedium.
Och erhålla Z-stack bilder för varje riktad neuron. Typiska pyramidala nervceller i hippocampus regionen i rat hjärnan avsnitten identifierades med ballistiska märkning teknik som kännetecknas av en stor apikala dendrite och flera mindre basala dendriter runt soma. Neuronal återuppbyggnad kvantitativ analys programvara användes för att spåra dendritic grenar och upptäcka spines.
Därefter användes programvaran för att bedöma dendritic förgrening komplexitet och neuronal arbor komplexitet. Morfologiska förändringar i dendritiska taggar bedömdes med hjälp av längd, volym och huvudet diameter. Då ryggrader klassificerades i tunna, stubby, och svamp ryggar.
Och den relativa frekvensen av antalet taggar mellan varje radie undersöktes. Ytterligare mer ballistiska märkning tekniken validerades på en primär pyramidal neuron i cellkultur. Pyramidal nervceller identifierades baserat på triangeln form av soma och stora apikala dendrite.
Sedan neuronal återuppbyggnad programvara användes för att analysera fördelningen av tunna dendritiska spines och dendritic spine längd. När du försöker detta protokoll, Det är viktigt att undvika stora klumpar eller kluster av ballistiska färgämne belagda volfram pärlor börjar beredning. Klumpar skulle inte tillåta enskilda nervceller som skall särskiljas.
Kombinerat med neuronal återuppbyggnad programvara denna metod tillåter oss att undersöka neuronal och dendritiska ryggrad morfologi i hippocampus pyramidala nervceller. Neuronal återuppbyggnad programvara utnyttja en algoritm för att erbjuda automatisk assisterad klassificering av dendritiska spines. Kvantifieringen av flera neuronala parametrar erbjuder en möjlighet att bättre förstå mekanismen bakom neuronal kognitiv dysfunktion.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
