Neuroscience
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マイクロ流体室システムを用いた運動ニューロン培養におけるオルガネラの軸索輸送
Chapters
Summary May 5th, 2020
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軸索輸送は運動ニューロンの健康にとって重要なメカニズムです。このプロトコルでは、マイクロ流体室を用いた運動ニューロン軸索における酸性コンパートメントおよびミトコンドリアの軸索輸送を追跡するための詳細な方法を提供する。
Transcript
軸索輸送は、神経の健康と生存率に不可欠です。当社のプロトコルは、軸索輸送を監視および分析するためのエレガントな方法を記述しています。そして、様々な神経疾患モデルに適応することができる。
マイクロ流体室の使用は、軸索生物学を研究するために重要である正確な空間時間制御を可能にする。軸索輸送異常は、ALSなどのいくつかの神経変性疾患に関係している。マイクロ流体プラットフォームは、基本的なメカニズムの研究と、軸索輸送欠陥を修復するための試験療法を可能にします。
マイクロ流体室プラットフォームは、軸索成長および様々な神経サブタイプの変性を含む軸索研究のさまざまな側面に合わせて容易に適合させることができる。この方法は複雑で、通常は実践的に教えられています。視覚的なデモンストレーションは、軸索輸送の研究に興味のある科学者にこの手順のアクセシビリティを高める。
まず、PDMS を一次金型にキャストします。加圧空気を使用してウェハプラットフォームから汚れを取り除き、ウエハーが滑らかで明確に見えるようにしてから続行します。次に、液体窒素で容器を満たし、23ゲージ針で10ミリリットルの注射器を調製します。
化学フュームフード内に、封止容器に封入可能な容器にウェハ含有プレートを入れ、プレートを含む各ウエハにつき2ミリリットルの液体窒素をシリンジに充填する。クロロトリメチルシランボトルを開けます。ゴムキャップに注射器を突き刺し、ボトルに窒素を注入します。
針を引き出さずに、ボトルを逆さまにし、プレートを含むウエハーごとにクロロトリメチルシランを2ミリリットル引き下げる。クロロトリメチルシランを容器に広げるが、ウエハ含有プレート上に直接入っていない。コンテナーを閉じます。
そして、ウエハースあたり5分間インキュベートします。次に、50ミリリットルチューブ内のPDMSベースの47.05グラムを秤量し、合計50グラムの硬化剤に対して16〜1塩基の割合でPDMS硬化剤を添加する。低速ローテーターでPDMSを10分間混ぜ、その後、プレートを含む各ウェハに所望の高さに注ぎます。
真空デシケータの中にプレートを2時間置きます。これはPDMS内に閉じ込められた空気を除去し、明確な均一な型を形成する。その後、オーブンでプレートを3時間または70°Cで一晩インキュベートします。
マイクロ流体室またはMFCを作成します。PDMS金型をメスでプレートから切り取り、取り外し、壊れやすいので金型を強制しないようにします。実験的なセットアップに応じて、部屋をパンチし、カットするテキスト原稿の指示に従ってください。
脊髄外植培養の場合は、大きなMFCの遠位側に7ミリメートルの井戸を2つパンチし、チャネルの端と重なるようにします。近位側では、チャネルの中央に7ミリメートルを十分にパンチして、最小限の重なりを付け、外植に十分なスペースが残されるようにします。近位チャネルの 2 つのエッジに 2 つの追加の 1 ミリメートルの穴をパンチします。
そして、単一のチャンバーにPDMSをカットします。その後、MFCを上向きに回し、20ゲージの針を使用して、パンチされた7ミリメートルの井戸に3つの小さな外植洞窟を彫ります。解約された運動ニューロン培養の場合、小さなMFCの2つのチャネルの端に4つの6ミリメートルの井戸をパンチし、PDMSを単一のチャンバーに切断します。
MFCを殺菌するには、長さ50センチメートルの粘着テープバンドをベンチに広げます。その後、テープ上のチャンバーの両方の面を押し、それを引き戻します。クリーンチャンバーを新しいプレートに入れ、軌道シェーカーで10分間70%エタノールの分析グレードでインキュベートします。
エタノールを処分し、チャンバーを組織培養フードまたはオーブンで摂氏70度で乾燥させます。次に、チャンバーを組織培養グレードのガラス底溝の中央に置き、エッジに軽微な力を加えてPDMSを皿底に結合させます。70°Cで10分間インキュベートします。
その後、密着を強化するためにチャンバーを押します。皿をUVで10分間インキュベートし、MFCのコーディングに進みます。両方のコンパートメントに1ミリリットルのPLOあたり1.5ナノグラムを加えます。
PLOがチャネルを通して実行されていることを確認します。チャネル入口に直接コーティング媒体をピペット化することによって。MFCを光顕微鏡で調べて、気泡がないか確認します。
気泡がマイクロ溝をふさいでいる場合は、2分間真空デシケータにMFCを入れます。MFC チャンネルから余分な空気を取り除きます。その後、PLOと一晩インキュベートします。
PLOをラミニンに置き換え、追加の夜のためにMFCをインキュベートします。めっきする前に、ラミニンを培養液で洗ってください。ICR E12.5妊娠マウスを解剖し、羊膜嚢から胚を分離する。
胚をHBSSシリコン皿に入れます。頭と尾を取り除き、彼の腹の上にひっくり返します。胚の表面性皮膚を後ろから静かに剥がし、脊髄を露出させる。
穏やかなピンセットを使用して、頭から尾に体から脊髄を分離します。髄膜を取り除き、後角を取り除き、脊髄を1ミリメートルの厚さの横切り部に切ります。MFC の近位コンパートメントからすべてのメディアを廃棄します。
ピペットを用いた単一の脊髄外植を、合計4マイクロリットルで拾う。そして、洞窟にできるだけ近いそれを注入します。横出口を介して近位ウェルから余分な液体を引き出す。
前の手順をさらに 2 回繰り返し、外植が近位チャネルに埋め込まれていることを確認します。近位ウェルにゆっくりと150マイクロリットルのSCEX培地を加えます。めっきの翌日。
近位コンパートメントにSCEX培地を交換し、遠位コンパートメントに豊富なSCEX培地を追加します。遠位と近位の井戸の間のウェルあたり少なくとも15マイクロリットルの体積勾配を維持する。4〜6日後、軸索は遠位コンパートメントに渡り、軸索輸送イメージングの準備ができている必要があります。
ミトコンドリアと酸性コンパートメントにラベルを付けるには、100ナノモルミトトラッカーディープレッドFM、および100ナノモルライソトラッカーレッドで新鮮なSCEX培地を準備します。そしてマイクロ流体室にそれを加える。37°Cで30〜60分間インキュベートします。
その後、暖かいSCEX培地で3回洗います。軸索輸送のライブイメージングを進めます。3秒間隔で100時間経過画像シリーズを取得する。
映画ごとに合計5分。マイクロ流体室で7日後。マウス胚性HB9 GFP脊髄外植。
私たちは、ミトトラッカーディープレッドとライソトラッカーレッド染料で染色されています。ミトコンドリアと酸性コンパートメントにラベルを付ける。遠位溝の軸索を画像化し、一般的な動き分布を決定するためにキモグラフ解析を用いた。
これは、酸性都市区画でのみ逆行方向のバイアスを明らかにしたが、ミトコンドリア輸送では明らかではなかった。粒子密度も定量化され、HB9 GFP脊髄外植軸索の酸性コンパートメントと比較してミトコンドリア粒子の数が多いことが明らかになった。次に、半自動ソフトウェアを用いて、社内コードを用いて単一粒子輸送解析を行った。
この分析により、酸性成分とミトコンドリアは粒子速度が似ていることが明らかになった。しかし、酸性コンパートメントだけが逆行運動に偏りを示します。最初は胚性脊髄を単離することは難しい場合があります。
正しい胚年齢と適切な解剖ツールを使用するように、この手順を数回練習してください。マイクロ流体室の使用は、軸索生物学の研究方法を変えます。これは、私たちがかつて細胞の体でのみ起こると仮定されている局所的な軸索プロセスを視覚化することができます。
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