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ここでは、線虫C.エレガンスにおける細胞タンパク質毒性ストレス応答を、蛍光転写レポーターの活性化を測定し、生理学的ストレスに対する感受性をアッテルすることによって特徴付ける。
これらの方法は、C.elegansのストレス応答を特徴付け、遺伝的または薬理的摂動が保護細胞経路の活性化に影響を与えるかどうかを判断するために使用することができる。これらの方法は、分子レベルと生理レベルの両方で遺伝子ノックダウンなどの何百もの摂動の迅速かつハイスループットテストを可能にします。アッセイが適切に行われるように、正および陰性の制御を含む。
健康で十分に供給された動物を適切な段階に同期させ、実験のために新鮮なプレートを使用します。ピックを使用したワームのマイクロマニピュレーションの視覚化は、新しいユーザーがワームをどのように並べて実行可能性を評価できるかを理解するのに役立ちます。手順を実証するには、フィル・フランキーノ、ホリー・ギルデア、メリッサ・メトカーフ(当研究室の大学院生)が参加します。
熱ショックタンパク質4のプロモーターの下でGFPを発現する動物を使用して、タンパク質応答を展開し、L4段階まで20°Cで同期したレポーター動物を成長させ、M9培地を使用してワームをプレートから洗い流し、チューブに移す。遠心分離によってワームを収集した後、M9をコントロール動物の管内のM9またはM9の目的の薬物の1ミリリットル当たり25ナノグラムに置き換えます。その後、20°Cで3〜4時間回転プラットフォーム上にワームを置きます。
インキュベーションの終わりに、M9の15ミリリットルだけで処理溶液を置き換える前に、治療溶液を沈着させる前に、遠心分離する。2回の打ち上げの後、必要に応じて動物をNGMプレートまたはNGM RNA干渉プレートに移し、ワームが摂氏20度で一晩回復できるようにします。ワームが回復したら、細菌なしで標準的なNGMプレートに100ミリモルナトリウムアジドの5〜10マイクロリットルを加え、解剖顕微鏡の下にワームのプレートを置きます。
プレートからアジ化ナトリウムのスポットに10〜20匹の動物を移す。動物は塩溶液に着陸した直後に動きをつかむべきです。アジドナトリウムが蒸発したら、すべての動物に対して同じ向きの前側と後部側を使用して所望の画像設定で動物を整列させ、すぐに動物のプレートをステレオ顕微鏡の下に置きます。
ステレオ顕微鏡イメージングソフトウェアを起動し、取得タブで[プロジェクトとフォルダを開く]をクリックして新しいプロジェクトを開きます。右クリックして[名前の変更]を選択し、フォルダの名前を変更します。ワームサンプルを顕微鏡の目的の下に配置し、ブライトフィールド設定を使用してワームの正しい焦点を特定して蛍光漂白を最小限に抑えます。
サンプルの中心は、卵の線がはっきりと見え、あいまいではない点になります。露出時間を設定して、ピクセルが飽和しないようにし、信号が検出限界を超えるようにします。露出時間、ズーム、フォーカス、およびブライトフィールド凝縮器を適切な設定に設定したら、キャプチャイメージボタンをクリックして画像を取得します。
化合物広視野顕微鏡を用いたイメージングの場合、ベースライン制御処理プレートを化合物広視野顕微鏡ステージに配置し、タッチパッドを使用して制御プログラムを起動します。新しいアルバムとファイル名を作成し、プレートを対物レンズの下に配置します。ベースラインコントロールとポジティブコントロールプレートを使用して、信号が見えるが飽和しないように、露出時間と蛍光強度を設定します。
その後、ブライトフィールドとGFP FITC画像を保存します。大粒子フローサイトメトリーによるレポーターの誘導を定量化するには、まずサイトメーターレーザーをオンにして、サイトメーターソフトウェアを開きます。ソフトウェアウィンドウでレーザーをオンにするをクリックし、アルゴンレーザーコントロールポップアップウィンドウでレーザーを開始するために実行をクリックします。
レーザーが約12ミリワットに達し、488光源レベルが約12に上がったら、完了をクリックして4つの圧力値を確認します。値が元の設定で観察されたものと同様の場合は、[圧力OK]ボックスをオンにします。次に、流れセルを通るシースとサンプルの流れを遮断する気泡や破片がないことを確認するには、数回きれいにクリックします。
その後、流れを再開するために、ソートとシースのスイッチを切ります。流量を確認するには、シースを60秒間回収します。シースを15ミリリットルのチューブに60秒間回収します。
流量は毎分9〜10ミリリットルでなければなりません。サンプルを実行するには、信号が検出限界を超えて飽和限界を超えないほど高いレベルにレーザー光増倍数の電力を調整します。サイズ・ギャティングを行い、気泡、破片、卵、その他の不要な小粒子を除外し、成人などの目的の動物のみを含むようにします。
スクリーニングパラメータが設定されたら、準備したワームをカップに追加し、[取得]をクリックします。これは、フローサイトメーターが空気を取り込み、検出器内の気泡を作成するので、液体のすべてが機械に取り込まれていないことを確認するために見てください。サンプルが少ない場合や十分な動物が収集されたら、[停止]をクリックします。
サイズ制約のみに基づいてゲート データを格納するには、[設定]、[データ ストレージ、ゲートのみ]、および [ゲート付きの格納] をクリックしてデータを保存します。次に、回収カップを脱イオン水で洗い流し、次のサンプルで分析を繰り返す前に、真空で洗浄を3回取り除きます。ミトコンドリアと酸化ストレス感受性を測定するには、M9のパラコート50〜75マイクロリットルを平らな底96ウェルプレートの状態ごとに8〜10の井戸に加え、パラコートの各ウェルに条件ごとに8〜10ワームを移送します。
2時間ごとにプレートを軽くタップして、生きている動物をスラッシュまたは曲げさせ、井戸あたりの死んだ動物の数を得点できるようにします。動物の温度感受性を測定するために、20°Cで3〜4日間ワームをインキュベートしてから、1皿あたり10〜15匹の動物を合計4〜6プレートでメッキします。その後、プレートを摂氏34度または37度のインキュベーターに入れ、ちょうど実証したように2時間ごとにワームの生存率をスコアリングします。
hsp-4レポーターは、ストレスがない場合には基底印象が最小限であるが、動物がチュニカマイシンの薬物を用いて小胞体ストレスにさらされると、堅牢なGFP発現を示す。これらの違いは、大粒子流サイトメーターを用いて定量化することもできる。また、小胞子ストレス下での導入遺伝子の誘導は、RNA干渉を介したXBP-1のノックダウンによって完全に抑制され得る。
同様のアッセイを行い、ミトコンドリア応力、酸化ストレス、熱ストレスを測定することができます。ストレスに対する動物全体の生理学的応答は、いくつかの生存アッセイを用いて測定することもできる。例えば、ツニカマイシンへの曝露は、小胞子ストレス感受性を測定するために使用される。
XBP-1遺伝子のノックダウンは、チュニカマイシンに対する感受性の有意な増加をもたらす。さらに、化学薬品パラコートへの曝露は、酸化およびミトコンドリアのストレス感受性を測定するために使用される。DAF-2遺伝子のノックダウンは、パラコートに対する耐性の有意な増加をもたらす。
耐熱性は、高温での動物の生存期間を決定することによって測定することができ、生存曲線としてプロットすることができる。これらのアッセイは少なくとも4〜6回実行されるべきであり、耐熱性は他のストレスアッセイと比較して非常に高い変動性を示すので、すべての複製は互いにプロットされるべきである。動物をイメージングする場合、信号の飽和度が過ぎないようにパラメータを設定し、実験全体で同じパラメータが使用されるようにすることが重要です。
ここで説明するイメージングプロトコルは、ゲノムワイドスクリーンを含む大規模スクリーニングに適しており、探索的および確認的な研究の両方に適しており、その後に記載された生理学的アッセイによってフォローアップすることができます。
