Immunology and Infection
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Retrovirale Überexpression von CXCR4 auf murine B-1a-Zellen und Adoptivtransfer für gezielte B-1a-Zellmigration zur Knochenmark- und IgM-Produktion
Chapters
Summary May 31st, 2020
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Hier beschreiben wir eine Methode zur retroviralen Überexpression und Adoptivübertragung von murinen B-1a-Zellen zur Untersuchung der in vivo B-1a-Zellmigration und -lokalisierung. Dieses Protokoll kann für verschiedene nachgelagerte funktionelle Assays erweitert werden, einschließlich der Quantifizierung der Spender-B-1a-Zelllokalisierung oder der Analyse von spenderzellabgeleiteten sekretierten Faktoren nach der Übertragung.
Transcript
Dieses Protokoll kann bewerten, wie sich die gezielte Genabgabe auf die B-1a-Zelllokalisierung und -funktion auswirkt, und kann ein nützlicher Beweis für den Konzeptansatz für die Untersuchung von Gentherapiepotenzialen in vivo sein. Diese Methode bietet eine stabile und relativ effiziente Genabgabe an primäre B-1a-Zellen und ermöglicht die Identifizierung des Spenderzellphäphänotyps und der Funktion nach der Adoption. Diese Methode kann verwendet werden, um verschiedene Spender- und Wirtszellprozesse in vivo zu untersuchen, einschließlich Zellüberleben, Proliferation und Funktion, und kann auf andere Adoptivtransfersysteme angewendet werden.
Peritoneale Flüssigkeitsernte kann schwierig sein. Achten Sie darauf, die Zellen gründlich zu lösen, um die Erholung zu maximieren und zu vermeiden, dass der Darm, der Ihre Peritonealzellpopulation kontaminieren kann, durchsetzt wird. Für die peritoneale B-1-Zellsammlung verwenden Sie eine gerade chirurgische Schere, um einen oberflächlichen Schnitt im Bauch einer 12 bis 14 Wochen alten, männlichen, CD45.1+apolipoprotein E Knockout-Maus zu machen, und verwenden Sie eine gekrümmte Schere, um die Haut zurückzuschälen, um die Peritonealwand freizulegen.
Mit einer 10-Milliliter-Spritze mit einer 25-Meter-Nadel, spülen Sie die Peritonealhöhle mit 10 Milliliter 37 Grad Celsius RPMI-1640 Medium. Und greifen Sie die Basis des Schwanzes, damit die Maus 15 bis 20 Sekunden lang gründlich von Seite zu Seite geschüttelt werden kann. Nach dem Schütteln, verwenden Sie die Spritze, um die Flüssigkeit von der unteren rechten Seite des Peritoneums knapp über dem Niveau der Hüfte, in der Nähe des Darms zu aspirieren, wobei darauf zu achten ist, dass die epidydimalen Fettdepots und die darunter liegenden Organe nicht gestört werden.
Nachdem Sie sechs bis sieben Milliliter Lavage gesammelt haben, geben Sie die Flüssigkeit in eine 50 Milliliter konische Röhre auf Eis. Verwenden Sie Zangen, um die Peritonealwand über dem Zwerchfell zu erfassen, um eine vertikale Höhe des Tieres zu ermöglichen, so dass die verbleibende Flüssigkeit am Boden der Peritonealhöhle verbleibt. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen kleinen Schnitt in der Peritonealwand über der Leber zu machen, ohne die Leber selbst zu schneiden.
Und verwenden Sie eine Glaspipette und Glühbirne, um die verbleibende peritoneale Flüssigkeit zu sammeln. Wenn die gesamte Flüssigkeit gesammelt wurde, aliquot die peritonealen Auswaschzellen von allen Mäusen und addieren bis zu einem mal 10 zu den achten Zellen pro Rohrkonzentration in 50 Milliliter Röhren auf Eis. Und sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation.
Setzen Sie jedes Pellet in einem Milliliter Anti-CD16/CD32-Antikörper aus, der im Verhältnis eins bis 50 im Assaypuffer für eine 10-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius verdünnt wird. Am Ende der Inkubation, fügen Sie ein gleiches Volumen der biotinylierten Antikörper-Master-Mix zu jedem Rohr für eine 20-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius gefolgt von einer Wäsche in fünf Milliliter Assaypuffer pro Tube. Setzen Sie die Pellets mit dem entsprechenden Volumen an Antibiotin-Mikroperlen und der entsprechenden Inkubationsdauer gemäß der Zellkonzentration und der Empfehlung des Herstellers auf, gefolgt von einer Fünf-Milliliter-Assay-Pufferwäsche pro Tube.
Setzen Sie jedes Pellet in 500 Mikroliter Assaypuffer wieder auf und grundieren Sie die entsprechende Anzahl magnetischer Selektionsspalten mit drei Millilitern Assaypuffer pro Spalte. Übertragen Sie die Zellen auf grundierte Säulen, die das Eluent mit angereicherten B-1-Zellen in einem 15 Milliliter konischen Rohr auf Eis sammeln. Waschen Sie dann jede magnetische Selektionssäule mit zusätzlichem Assaypuffer, bis das gesamte gesammelte Volumen 10 Milliliter beträgt, und setzen Sie die postgereinigte Zellfraktion um ein mal 10 bis die sechste Zelle pro Milliliter Konzentration im B-Zellkulturmedium wieder auf.
Um die peritonealen B-1-Zellen zu stimulieren, legen Sie mindestens ein mal 10 zu den siebten Zellen für eine nicht transduzierte Kontrolle beiseite und teilen Sie die verbleibenden Zellen in zwei gleiche Volumina für die Transduktion auf. Verdünnen Sie die Zellen auf 1,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro 150 Mikroliter mittlerer Konzentration und fügen Sie 150 Mikroliter Zellen zu Denbrunnen einer 96-Well-Rundbodenplatte für transduktionsbedingte Bedingungen hinzu. Dann fügen Sie 100 Nanomolar TLR9 Agonist zu jedem Brunnen und legen Sie die Platten in der Zellkultur Inkubator für 16 bis 18 Stunden.
Zur retroviralen Transduktion der peritonealen B-Zellen tauen die retroviralen Partikelbestände an Calciumphosphattransfektion auf Eis auf und tragen sofort die Kontrolle und den Chemokinrezeptor retrovirale Überräube in jedem Brunnen der geeigneten Platte und eine Vielzahl von Infektionen von 20 bis eins in Gegenwart von 8 Mikrogramm pro Milliliter Polybren und frischem Beta-Mercaptoethanol bei 55 Mikromollar-Endkonzentration hinzu. Wenn alle Viren hinzugefügt wurden, spritzen Sie die Zellen durch Zentrifugation und legen Sie die Platten drei Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator. Am Ende der Inkubation ernten Sie die Zellen zum Replatieren in frischem B-Zellmedium und einer nächtlichen Inkubation.
Nach der magnetischen Erschöpfung anderer Peritonealzelltypen haben lebende Einzelzellen in der Post-Depletion-Fraktion einen größeren Anteil an CD19+B-Zellen im Vergleich zu F4/80+Makrophagen und einem Mangel an CD5hi CD19-T-Zellen, und sie enthalten eine erhöhte Frequenz von CD19+CD5-Medium-B-1a-Zellen im Vergleich zur Vorerschöpfungsfraktion. Und die Erhöhung der Häufigkeit der erfolgreich transduced GFP+B-2, B-1, B-1a, und B-1b Zellteilmengen ist direkt mit der Zunahme der Virusvielfalt der Infektion korreliert. Und die Transduktionseffizienz kann mit 96 gut runden Bodenplatten im Vergleich zur Verwendung von 24-Well- oder 6-Well-Platten weiter gesteigert werden.
Die CXCR4-GFP-Retrovirus-Transduktion kann eine erfolgreiche B-1-Zell-CXCR4-Überexpression auslösen und die In-vitro-Migration in Richtung CXCL12 erhöhen, ohne dass dies erhebliche Auswirkungen auf die B-Zell-Lebensfähigkeit hat. Darüber hinaus erhielten adoptiert übertragene CD45.1+Spenderzellen ihre CXCR4-Überexpression nach ihrer Genesung aus dem Knochenmark und Milz von CD45.2-Empfängermäusen 17 Wochen nach der Zellübertragung. Bemerkenswert ist, dass ein positiver Zusammenhang zwischen der CXCR4-Expression und der Spenderzelllokalisierung zum Knochenmark, aber nicht milden festgestellt wurde.
Mit einem positiven Zusammenhang zwischen Spenderzellzahlen im Knochenmark und der Plasmamenge von Anti-MDA-Low Density Lipoprotein IgM. Viele zusätzliche Techniken können verwendet werden, um Fragen zu beantworten, wie, was sind die Auswirkungen der gezielten Genabgabe auf die Krankheitsentwicklung oder welcher Spender abgesonderte Faktoren beeinflussen wirphysiologie.
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