Bioengineering
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Hög genomströmning jäst stam fenotypning med droplet-baserade RNA sekvensering
Chapters
Summary May 21st, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
En flaskhals i "design-build-test" cykel av mikrobiell teknik är den hastighet med vilken vi kan utföra funktionella skärmar av stammar. Vi beskriver en hög genomströmning metod för stam screening tillämpas på hundratals till tusentals jästceller per experiment som använder droplet-baserade RNA sekvensering.
Transcript
ICO, eller ICO-seq är den första anpassningen av RNA-sekvensering med hög genomströmning till mikrober. Denna metod bedömde mikrobiell funktion i en genom-bred skala. För konstruerade mikrober kan denna metod belysa hur förändringar i det mikrobiella genomet kan perturb dess funktioner.
Erhåll jäst från en suspensionskultur, och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Åter avbryta cellerna i PBS vid en koncentration av cirka 750, 000 celler per milliliter. Blanda därefter ultralåg smältpunkt uppstod i PBS, och värm blandningen vid 90 grader Celsius, tills agarose smälter.
Ladda agarosblandningen i en spruta, med ett bifogat 0,22 mikronfilter. Placera en sprutpump framför en rymdvärmare inställd på 80 grader Celsius och placera sprutan i pumpen. Fyll en andra spruta med jäst suspension, och fyll en tredje spruta med fluorerad olja, med 2%joniska fluorosurfactant.
Ladda båda sprutorna i sprutpumparna. Anslut slangen från sprutorna till enheten A.Placera ett koniskt rör på 15 milliliter i en ishink och styr inloppet i det koniska röret. Ställ in flödeshastigheten för varje spruta, och samla in ungefär en milliliter emulsion i det koniska röret på 15 milliliter.
Efter att ha väntat fem minuter för agaros i röret för att ställa, tillsätt en lika stor volym på 20%perfluoro-oktanol i fluorerad olja till emulsionen. Blanda emulsionen och perfluor-oktanolen genom att invertera det koniska röret några gånger. Centrifugera den trasiga emulsionen vid 2, 000 gånger G i två minuter.
Var noga med att hydrogelerna har pelleterat ovanför olje- och PFO-faserna. Ta bort oljan och PFO-faserna. Tillsätt två milliliter tet(W)buffert för att åter upphäva hydrogelerna.
Överför suspensionen till ett nytt koniskt rör på 15 milliliter. Centrifugera röret igen vid 2, 000 gånger G i två minuter. Ta bort supernatanten, och åter upphäva hydrogelerna i tet(W)igen.
Efter att ha snurrat ner hydrogelerna vid 2, 000 gånger G i två minuter, åter upphäva hydrogelerna i två milliliter jäst odling medium. Inkubera röret över natten vid 30 grader Celsius, med skakningar. Varje stammar växer i olika takt.
Att välja en lämplig media och inkubationstid är avgörande för att säkerställa att jästen växer inom hydrogel, men inte överväxer, vilket leder till celler som flyr in i media. För det första, överför hydrogelerna till ett koniskt rör på 15 milliliter. Centrifugera röret vid 2, 000 gånger G i två minuter.
Tvätta hydrogelerna två gånger med PBS och sedan en gång i spheroplasting buffert. Utför en 40x utspädning av spheroplasting enzym i spheroplasting buffert. Tillsätt sedan en milliliter av det utspädda enzymet till hydrogelerna.
Inkubera tuben av hydrogeler vid 37 grader Celsius i en timme. Den behandlade jästen kommer att se mer transparent. Från röret som innehåller hydrogelupphängningen, dra tillbaka 0,8 milliliter av suspensionen från botten av röret, och överför den till en en milliliter oklänsad spruta.
Placera sprutan i den 3D-tryckta spruthållaren. Centrifugera sprutan och hållaren vid 2, 000 gånger G i två minuter. Innan du fortsätter, se till att hydrogelerna är tätt packade i botten av sprutan.
Placera 240, 000 drop-seq pärlor i en 15-milliliter koniska röret. Centrifugera röret vid 1, 000 gånger G i en minut. Ta bort supernatanten och dra upp pärlorna på två milliliter på 0,9 x jästsvampsbuffert, med 500 millimolarnatriumklorid.
Sätt i en omrörningsstång och överför pärlfjädringen till en tre-milliliter spruta. Förbered ytterligare en spruta, innehållande flera milliliter PFPE-PEG-ytaktivt i fluorerad olja. Skaffa den tidigare beredda sprutan av jästklon packade hydrogeler.
Evakuera acquiesce huvudet, och mössa sprutan. Sätt in de tre sprutorna, hydrogelerna, pärlfjädringen, och oljan i sprutpumpar. Anslut sprutorna via slangar till apparat B, inkapslingsanordningen.
Placera slutet av utloppsslangen i ett koniskt rör på 50 milliliter på is. Ställ in flödeshastigheten för varje spruta. Samla in ungefär 1, 000 milliliter emulsion, eller kör enheten tills det inte finns några hydrogeler kvar.
Följ sedan drop-seq-protokollet för cDNA-syntes, biblioteks prep och sekvensering. Med hjälp av en mikrofluidisk enhet, jästceller var inkapslade i 160-mikrometer droppar. En åttafaldig splitter delade dessa droppar i åtta 60-mikrometerdroppar.
Inkubation över natten resulterade i att isogena jästkolonier växte inom några av hydrogelerna. Innan lastning jästen hydrogels i den andra mikrofluidiska enheten, de tvättades och nedsänkt i en lösning för att smälta cellväggarna. Korrekt matsmältningen kontrollerades genom mikroskopi, med behandlade jästceller har en mer reflekterande morfologi.
En ström av mRNA fånga pärlor i lysis buffert blandades med en ström av nära-pack jäst hydrogeler före dropp-making korsningen av den andra mikrofluidic enheten. I den resulterande emulsionen innehöll cirka 10%av de insamlade dropparna en pärla med en lyst koloni. Denna isogenic colony sekvensering arbetsflödet användes för att analysera den vita ogenomskinliga växling svar c.albicans.
Principal komponent, PC, analys och en tSNE dimensionalitet minskning anges allmän konkordans mellan urvalet datamängden och en referens datamängd. TSNE analys visade tre kluster av celler. Medan kluster två huvudsakligen bestod av celler från urvalsdatamängden bestod kluster noll och en av celler från båda urvalen.
Överläggning WH11 uttryck på tSNE anges att kluster en sannolikt innehöll vita kolonier. STF2-uttryck ökade i kluster ett, överensstämmer med tidigare erhållna data. I kluster noll och två, WH11 och STF2 var betydligt nedreglerade jämfört med kluster ett.
Androgen mikrober har en ständigt ökande potential att massproducera biologiska läkemedel för behandling av en mängd olika sjukdomar. Efter denna procedur kan man tillämpa en mängd olika bioinformatiska verktyg för att ytterligare analysera sekvenseringsdata.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
