Mätning ran peptid toxicitet i C. elegans

RAN peptider är ett inslag i upprepa expansion neurodegenerativa sjukdomar såsom Huntingtons sjukdom, amyotrofisk lateral skleros, och frontotemporal demens. Dessa protokoll ger ett viktigt standardiserat tillvägagångssätt för kvantifiering av RAN-peptidtoxicitet i C.eleganss modellsystem. De tekniker som beskrivs är enkla att lära sig och billiga, kan utföras snabbt, och utnyttja reproducerbara funktioner i C.elegans systemet såsom rörelse och reproduktion.

När du försöker detta protokoll, den stora utmaningen är att få konsekvent RAN peptid toxicitet och uttryck. De viktigaste faktorerna för att kontrollera inkluderar läkemedelstemperatur, tidpunkten för temperaturförändringar och beredning av analysplattor. Det är viktigt för försöksmän att konsekvent klassificera fenotyperna av djuren i denna åldersberoende process assay.

Visuell demonstration av denna teknik visar deras klassificeringskriterier. Börja med att hälla standard nematod tillväxtmedium med en millimolar IPTG och 25 mikrogram per milliliter carbenicillin i 24-brunns plattor. Strimmig ut RNAi utfodring kloner i HT115 bakterier på LB carbenicillin agar och odla dem på 37 grader Celsius i 24 timmar.

På nästa dag, plocka en enda koloni i en milliliter av LB carbenicillin flytande media och odla bakterierna i 18 timmar vid 37 grader Celsius medan skakar på 250 rpm. Spot fyra enskilda brunnar av NGM RNAi 24-brunnsplatta med 20 mikroliter av över natten bakteriekulturer som beskrivs i texten manuskriptet och låta RNAi bakterier att inducera dubbelsträngad RNA produktion över natten. Använd standardhypokloritmetoden för att isolera ägg från dag ett vuxen C.elegans som uttrycker den integrerade RAN-peptidtransgenen.

Sedan utsäde cirka 30 ägg i varje brunn av 24-brunnsplattan och ruvar plattan vid 20 grader Celsius i sju dagar. För att utföra videohastighetsanalys, förvärva två videor från två separata brunnar för varje RNAi-tillstånd med hjälp av ett stereo dissekering mikroskop utrustat med en monokrom kamera. Se till att använda konsekventa förvärvsinställningar mellan brunnar.

För varje video ställer du in varaktigheten för 10 sekunder och tidsintervallet till 76 millisekunder. Ställ in bildexponeringstiden på fyra millisekunder och använd zoominställningen 1,49. Välj sedan två av två binning.

Kontrollera att upplösningen är 800 med 600 pixlar och börja spela in. Efter förvärvet, etikett varje video omedelbart med stammen, RNAi skick och väl nummer. Mät sedan den tillryggamen för sträckan och längden på varje djur för 20 olika djur per video, och undersöker totalt ca 40 maskar för varje RNAi-tillstånd.

Välj knappen anteckningsverktyg i programvaran. Sedan verktyget rita text. Klicka på en punkt i mitten av masken mäts i den första bildrutan i videon och markera den med ett nummer.

För videon till slutet medan du visuellt spårar masken. Klicka sedan på den och markera den med nästa motsvarande nummer. Använd verktyget rita skala bar för att dra en linje från det första numret till det andra numret och spela in den sträcka som reste i ett kalkylblad.

Upprepa denna mätning för 19 andra maskar i videon samtidigt som varje enskild mätning bevaras i analysfönstret. När mätningarna är klara, ta en ögonblicksbild av den slutliga videoramen som illustrerar alla mätlinjer så att data kan spåras tillbaka till det djur som de härstammar från. Därefter analysera data med hjälp av en fyra-kolumn kalkylblad där kolumn ett är masken identifierare och kolumn två är hastigheten.

Tiden för varje video kan hittas genom att högerklicka på videon under experimentet och gå till egenskaperna. För att normalisera hastighetsmätningen, hitta längden på varje djur. Använd dragpolylineverktyget för att fritt spåra C.elegansen från spetsen till svansspetsen.

Ta sedan en ögonblicksbild av den slutliga videobildrutan som illustrerar alla polylinjer. Längden på linjerna kommer att registreras under statistik. Lägg till två kolumner i kalkylbladet, en för djurens längd och en för normaliserad hastighet.

Slutligen analysera den normaliserade hastighetsdata med hjälp av en enkelriktad ANOVA med post-hoc-testning kontra tom vektor RNAi. Placera fyra till sex transgena L4 C.elegans som uttrycker RAN peptid GFP på en sex centimeters GFP RNAi-platta och odla dem i 20 grader Celsius. Om experimentet utnyttjar RNAi för att testa för genetiska effekter på RAN peptid toxicitet, flytta 10 transgena gravid vuxna till var och en av två tomma vektor RNAi GFP RNAi eller genspecifika RNAi plattor.

Om mutanter används för att analysera genetiska effekter på RAN peptid toxicitet, placera 10 gravid vild typ eller muterade djur som uttrycker samma RAN transgen på var och en av två tomma vektor RNAi eller GFP RNAi plattor. Odla dem i 20 grader Celsius i 48 timmar. Plocka 10 uppsättningar av 10 transgena L4s från RNAi plattorna och placera varje uppsättning på en tre centimeter RNAi platta.

Se till att maskarna som valts ut för analysen alla har ytligt normal motilitet. Placera plattorna i en plastpåse för att behålla fukt och inkubera dem i 25 grader Celsius. Efter 24 timmar, analysera djuren för rörlighet genom att knacka plattorna på dissekera mikroskop och kontrollera för rörelse.

Om en mask rör sig mer än en kroppslängd, räkna den som mobil och överför den till en ny tre centimeter RNAi-platta. Använd en platinaplockning för att knacka på de återstående maskarna på huvud och svans. Om djuret rör sig mer än en kroppslängd, räkna djuret som mobilt och överför det till en ny tre centimeters RNAi-platta.

Om betydande förlamning inte observeras i den tomma vektorn kontroll av dag två, avsluta analysen och börja om. Gruppera alla icke-uppdykande maskar tillsammans så att rörelsen av mer än en kroppslängd lätt kan upptäckas. Räkna alla förlamade, säckar, eller döda maskar och kasta plattan.

Fortsätt att göra poäng för förlamning varje dag i fem till sju dagar. Tillväxtanalysen användes för att mäta effekten av genhämningar på toxiciteten hos RAN-dipeptider som finns hos ALS-patienter med en G4C2-upprepningsexpansion. Uttryck för PR50 GFP ensam resulterade i en fullständig tillväxt gripande, men knockdown av flera gener undertryckt utvecklingstoxicitet.

Effekten av specifika gen knockdowns på utvecklingsmässiga motility av PR50 uttrycka djur mättes med hjälp av video hastighet analysmetod. Som väntat, hämning av PR50 GFP uttryck resulterade i en stor ökning av motility jämfört med tomma vektor RNAi. Vidare resulterade RNAi mot proteasom subunit RPN7 i den betydande ökningen av PR50 motility.

När vuxna fenotyper analyserades med åldersberoende förlamning analysen uppvisade PR50 GFP upp till 80%förlamning av fem dagars ålder. RNAi riktade dock mot genen cul-6 betydligt fördröjd förlamning tyder på att cul-6 krävs för PR50 GFP toxicitet. För att avgöra om RAN-proteiner orsakar neuropatologi när de uttrycks i C.elegans nervceller, undersöktes neuron-specifik toxicitet med hjälp av commissure assay.

I dag två vuxna, PR50 GFP uttryck i motor nervceller ledde till en betydande ökning av motor neuron blebbing. Denna neuropatologi var betydligt undertryckt av en mutation i insulin IGF receptorn genen homolog DAF-2 som försenar de toxiska egenskaperna hos flera neurodegenerativa proteiner. För beteendeanalysen är det viktigt att RAN-peptiderna producerar en mycket penetrerande fenotyp.

Sådana gener eller läkemedel kan ge nya biomarkörer eller terapeutiska alternativ för RAN peptidsjukdomar. Med hjälp av dessa analyser har vi utfört en genom-bred RNAi skärm för suppressors av C9ORF72 associerade RAN peptid proline-arginin. Gener som identifierats i denna skärm inkluderar många nya och bevarade gener som kommer att bli föremål för framtida mekanistiska studier.