Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Merkezi Sinir Sisteminde Lenfosit Infiltrasyonunun Akış Sitometrik Analizi

Burada sunduğumuz protokol, lenfositlerin merkezi sinir sistemi otoimmün hastalığının gelişiminde nasıl rol aldığını anlamamıza yardımcı olacaktır. Bu yöntemle beyindeki lenfositler hücre bazında çalışılabilir. Bu protokol aynı zamanda bağışıklık hücrelerinin özelliklerini ve fonksiyonlarını analiz etmek için gerekli diğer modeller ve merkezi sinir sistemi hastalığı uygulanabilir.

Bu videoda, protokol kolayca model neden ve beyinde tek hücreleri izole nasıl gösterebilir. Pedal refleksyanıt eksikliği doğruladıktan sonra, subkutan döşeli C57BL/6 fareler emülsifiye MOG 35-55 100 mikrogram ile enjekte etmek için bir mililitreşli şırınga kullanın tam Freund’s adjuvan boynuna yakın iki farklı sitelere 100 mikrolitre. Aynı gün ve ikinci gün postimmunizasyon, intraperitoneally mikrolitre pertussis toksin çalışma çözeltisi başına bir nanogram 200 mikrolitre ile fareler enjekte.

İkinci enjeksiyondan sonra, fareleri bir ısınma yastığı ile ev kafesine geri aktarın ve tam işe kadar izleyin. Ertesi gün ve hastalığın seyri boyunca, tabloda özetlenen nörolojik işaretler ve kilo herhangi bir değişiklik için kör bir şekilde tüm farelerincelemek ve derece. Uygun deneysel bitiş noktasında, kafatasını burundan boyuna dikkatlice kesin ve her bir hayvanın beynini kafatası kutusundan 10 mililitre RPMI ortamı içeren 50 mililitrelik tüplere aktarın.

Yapışık kırmızı kan hücrelerini kaldırmak ve aspirasyon ile orta kaldırmak için tüpleri iyice karıştırın. Her tüp e 10 mililitre taze ortam ekleyin ve beyinleri 100 milimetrelik ayrı ayrı yemeklere aktarın. Son olarak bir jilet ile her beyin doğrayın ve bir seferde bir çanak kadar doku ve orta altı mililitre bir buzsoğuk yedi mililitre merkezli cam homogenizer içine aktarmak için plastik bir pipet kullanın.

Süspansiyon homojen olana kadar doku getirmek için sıkı piston kullanmadan önce havanesiz gevşek piston kullanarak beyin grind. Daha sonra, buz üzerinde önceden soğutulmuş 15 mililitrekonik tüp içine elde edilen doku bulamaç dökün. Tüm numuneler homojenize edildiğinde, her tüpteki hacmi taze orta ile yedi mililitreye ayarlayın, her doku süspansiyonu tüp başına %100 bazal membran matrisinüç mililitre içeren yeni bir soğutulmuş 15 mililitrelik tüpe eklemeden önce.

Birkaç kez ters tarafından karıştırın ve dikkatle ve yavaş yavaş her doku çözeltisi örnek altında yüzde 70 yoğunluk gradyan çözeltibir mililitre eklemek için üç mililitrelik pipet kullanın. Yoğunluk gradyan santrifüj ile hücreleri ayırın ve üst tabakanın hemen hemen tüm kaldırmak, tamamen tüm miyelin kaldırmak için özen. Arayüzü yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve hacmi taze orta ile 10 mililitreye ayarlayın.

Daha sonra numuneleri tekrar santrifüj edin ve tüp başına yaklaşık 100 mikrolitre orta peletleri yeniden sumadan önce süpernatantı çıkarın. Hasat edilen beyin hücrelerinin akış sitometrik analizi için, 100 mikrolitre ortadaki altı hücreye yaklaşık iki kez 10 ayırın. Tüm hücreler kaplandığında, kuyulara 100 mikrolitre 500X hücre stimülasyon kokteyli artı protein taşıma inhibitörleri ekleyin ve plakayı dört saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.

Kuluçka havuzunun sonunda kuyuların altındaki hücreler santrifüj ile ve kuyu başına 100 mikrolitre akış sitometri tamponunda peletleri yeniden askıya alın. Anti-Mouse CD16/CD32 Fc Block’un üç mikrolitresi ile hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Fc aracılı olmayan herhangi bir etkileşimi engellemek için.

Kuluçka sonunda, her kuyuya ilgi antikor kokteyli ekleyin ve plakayı ışıktan korunan dört dereceye yerleştirin. 30 dakika sonra kuyuları kuyu başına 100 mikrolitre akış sitometri tamponu ile yıkayın ve hücreleri santrifüj ile tortulayın. Supernatants attıktan sonra, her kuyuya 200 mikrolitre hücre içi fiksasyon tamponu ekleyin.

Oda sıcaklığında 30 ila 60 dakikalık bir kuluçkadan sonra, numuneleri santrifüj le toplayın ve kuyu başına 1X geçirgenlik tamponunun 200 mikrolitresinde peletleri yeniden askıya alın. Numuneleri tekrar santrifüj edin ve süpernatantı attıktan sonra, taze permeabilizasyon tamponu ile 100 mikrolitrede peletleri yeniden askıya alın. Daha sonra, ışıktan korunan 4 santigrat derecede 30 dakikalık bir kuluçka için herhangi bir hücre içi antijenin inkübasını tespit etmek için uygun antikorları ekleyin.

Kuluçka sonunda, her kuyuya 100 mikrolitre 1X permeabilizasyon tamponu ekleyin ve numuneleri santrifüj le aşağı çevirin. Daha sonra, akış sitometri boyama tampon 200 mikrolitre leke hücreleri resuspend ve standart protokollere göre akış sitometri ile hücreleri analiz. EAE tipik bir klinik ders bir hastalık eğrisi ve vücut ağırlığında değişiklik gibi gösterildiği gibi neden olmalıdır.

MOG 35-55 ile aşılanmış C57BL/6 fareler genellikle 10-12 gün civarında hastalık belirtileri geliştirmeye başlar ve 15-21 gün civarında hastalığın doruk noktasına ulaşmak. Hastalığın başlangıcından önce, bağışıklık farelerin vücut ağırlığı giderek artan hastalık belirtileri ile korelasyon azalan önce artar Fareler EAE zirvesinde en düşük vücut ağırlığı göstermek, klinik belirtiler azaldıkça vücut ağırlıkları biraz iyileşme ile. Fareler genellikle tam olarak ancak kurtarmak ve genellikle monophasic kronik hastalık patolojisi geliştirmek için devam yok.

Bu temsili akış analizinin de gösterdiği gibi, EAE farelerde interferon gama üreten Th1 ve IL17 üreten Th17 hücreleri önemli ölçüde artmaktadır. En önemli adım 3.10. Operatör orta tabaka ve ışık transferi gerekir, dikkatli olmak, mümkün olduğunca az diğer katmanları olarak almak.

Bu protokolü takiben, daha fazla transkripsiyon analizi için daha fazla T lenfositler çalışma