Optimalisering for sekvensering og analyse av degraderte FFPE-RNA-prøver

Vår protokoll kan brukes til å forbedre kvaliteten og mengden av genuttrykksdata generert fra FFPE-avledede RNA-prøver, spesielt i suboptimale kvalitetsprøver. Denne teknikken vurderer RNA-kvaliteten i FFPE-vevsprøver og muliggjør optimalisering av nedstrømsbehandlingen for å forbedre mengden og kvaliteten på prøvesekvenseringsdataene. Denne metoden tillater omfattende karakterisering av en transkripsjon i biologisk og klinisk prøve og kan gi innsikt i funksjonelle elementer av genomet i utvikling og sykdom.

FFPE-RNA-nedbrytningen og utvelgelsen av metodene for eksempel qc, bibliotekforberedelse og dataanalyse kan alle være svært vanskelig. Vær omhyggelig når du velger de riktige metodene og passende kontroller. Visuell demonstrasjon gjør det mulig for seerne å observere de små subtile endringene og forholdsreglene som trengs under planleggingen, vurderingen og sekvenseringsprosessen, spesielt for dårlig bevarte FFPE-prøver.

For å sjekke kvaliteten på RNA-prøven, kjør prøven på et RNA QC-system i henhold til produsentens instruksjoner og bruk riktig bioanalyseprogramvare for å analysere fordelingen av RNA-fragmentene i prøven og for å beregne andelen fragmenter som er lengre enn 100 og 200 nukleotider. Basert på QC-beregningene kan du identifisere prøvene med færre enn 40 % av fragmentene som er lengre enn 100 nukleotider for å tillate utelukkelse av disse prøvene fra behandling. For sekvensering, tin de riktige sekvensering reagenssettene i henhold til løpeparametrene i et romtemperaturvannbad og plasser reagensbrettet på fire grader Celsius etter tining.

Plasser strømningscellepakken ved romtemperatur i 30 minutter. Mens pakken varmes opp, åpner du Programmet Illumina Experiment Manager og velger Opprett eksempelark. Velg sequenceren som skal brukes, og klikk Neste.

Angi strekkoden for reagenssettet og de andre aktuelle arbeidsflytparameterne. Last deretter opp et eksempelark som er opprettet i henhold til Illumina-sekvenskriteriene. For å klargjøre eksempelbiblioteket og kontrollbiblioteket PhiX, denaturere og fortynne bibliotekene til de riktige konsentrasjonene og blande eksempel- og PhiX-kontrollbibliotekene for å oppnå et volumforhold på 5 %PhiX-kontroll.

Når strømningscellene er klare, fjern innpakningen, rengjør glassoverflaten med en lofri alkoholsletting og tørk glasset med lavt lolaboratorivev. Fjern reagenskassetten fra fire grader Celsius-lagring og inverter sylinderampullen fem ganger for å blande reagensene. Bank patronen forsiktig på benken for å redusere luftbobler og legg denaturerte og fortynnede prøven inn i reagenskassetten i det angitte reservoaret.

Legg strømningscellen, bufferkassetten og reagenskassetten på systemet. Utfør deretter en automatisk kontroll og se gjennom utdataene for å sikre at kjøreparametrene passerer systemkontrollen. Når den automatiske kontrollen er fullført, velger du start for å starte sekvenseringskjøringen.

Hvis du vil visualisere resultatene for QC før behandling og etter justering, kjører du multi-QC for å generere en aggregert rapport i HTML-format. Hvis du vil fastslå satsvise effekter og vurdere kvalitetstilordningen for det angitte datasettet, bruker du et R-skript til å kjøre en hovedkomponentanalyse. Eksempelkorrelasjonsanalyse kan deretter utføres ved hjelp av Pearson-korrelasjonen mellom ulike prøver.

Estimeringen av andelen fragmenter som er lengre enn 100 nukleotider er mer nyttig enn en estimering av fragmentene som er lengre enn 200 nukleotider fordi det er mer følsomt for nøyaktig måling av andelen mindre fragmentstørrelser for svært nedbrutte RNA-prøver. Gitt den høye graden av nedbrytning i prøvesettet, anbefales en total RNA-bibliotekforberedelsesmetode. Her vises for eksempel sekvenseringsbiblioteker utarbeidet fra fire forskjellige eksempler.

Her vises oversikter over rå FastQ-filsekvenseringskvalitet og eksempelkortinnhold. FastQC screening kan bidra til å oppdage forurensning som bakteriell eller mus forurensning i prøvene. STAR-justering kan brukes til å bestemme andelen av lesinger som er tilordnet referansegenomet, prosentandelen av leser unikt tilordnet referansegenomet, og andelen lesinger som ikke var tilordnet, eller som ble tilordnet til flere loci.

Kortet og RSeQC-statistikken kan brukes til å bestemme prosentandelen av messenger RNA-er, intronic- og intergene baser som finnes i de tilordnede lysene. For disse representative analysene hadde noen degraderte biblioteker en tre hovedbias der flere lesere ble kartlagt nærmere de tre prime enn til de fem prime end. I tillegg kan hovedkomponentanalyse utføres for å bestemme prosentandelen av den totale variasjonen som fanges opp av hovedkomponentene for de biologiske replikeringene i hvert utvalg.

Vær forsiktig med å unngå forringelse av prøver, klargjør repliker og flere strøk for hvert utvalg, bruk de riktige beregningene til å vurdere utvalgskvaliteten og bruke riktig bibliotekforberedelsesmetode. Ved hjelp av denne metodikken kan større NGS-studier utføres med tidligere ubrukelige FFPE-prøver med varierende lagringstider og forhold for å få innsikt i en rekke forskjellige sykdomstilstander. Denne teknikken banet vei for forskere å studere eksisterende store arkiver av FFPE utvalg med rik klinisk informasjon og kan i stor grad forbedre populasjonsbaserte kreftstudier.