Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
הכנת פרוסות היפוקמפוס אנושיות חריפות להקלטות אלקטרופיזיולוגיות
Chapters
Summary May 7th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
הפרוטוקול המוצג מתאר את ההובלה וההכנה של רקמת היפוקמפוס אנושית חתוכה במטרה האולטימטיבית להשתמש פרוסות מוח חיוניות ככלי הערכה פרה-קרטילי עבור חומרים אנטי אפילפטיים פוטנציאליים.
Transcript
באמצעות הטכניקה שלנו, אנו יכולים לבדוק חומרים אנטי אפילפטיים פוטנציאליים בתוך דגימות המוח האנושי כדי לסייע בפיתוח תרופות לאפילפסיה של האונה הרקתית. לרקמת המוח האנושית יש את היתרון של פריצת מכסה התרגום בין מחקר בסיסי ליישומים קליניים. ביום של ההליך או מאוחר ככל האפשר ביום הקודם, להפשיר 50 מיליליטר של פתרון 10x כולין aCSF באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולהוסיף את הפתרון המופשר ו 50 מיליליטר של פתרון 10x שניים עד כ 300 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים.
מוסיפים לתערובת ריכוזים סופיים של גלוקוז וסידן כלורי ומערבבים עד להמסה. לאחר מכן, מוסיפים מים מזוקקים כפולים לנפח סופי של 500 מיליליטר. למדוד את osmolarity.
ולמלא בקבוק עם כ 100 מיליליטר של aCSF כולין 1x. ביום של ההליך, לצנן את 1x כולין aCSF על קרח ולהשתמש מתקן גז זכוכית מחובר גז קרבוגן כדי carbogenate הפתרון לפחות 10 עד 15 דקות. לפחות 10 עד 15 דקות לפני ההליך, לפני המלחמה aCSF אחסון, אשלגן גבוה בתוספת 4 אמינו-פירידין aCSF, ומגנזיום נמוך בתוספת bicuculline ל 35 מעלות צלזיוס עם קרבוגניזציה.
כדי להכין את תא הממשק, חתוך שתי חתיכות נייר סינון באורך ארבעה על שני סנטימטרים עבור כל תא מחזיק פרוסות ועמוס את החלקים זה על גבי זה. לאחר מכן, מניחים חוטי כותנה דקים סביב חתיכות נייר הסינון בתוך התאים כדי לשבור את המתח של הפתרון ולהבטיח זרימה שווה. והצב שלוש עד ארבע חתיכות נייר סינון באורך 1.5 על 1 ס"מ על גבי פיסת נייר הסינון הגדולה יותר בכל תא.
לפני רכישת פרוסות הרקמה, יש להשתמש ב-70% אתנול כדי לנגב את אזור ההכנה ולהניח כיסוי על האזור. מניחים דבק סופר, שני פינצטה חדה, מרית, אזמל עם להבים, ולהב לחיתוך מחוספס של רקמת המוח ליד הרטט. מנגבים את מגש החיץ ואת צלחת הדגימה של הרטט עם 70% אתנול.
כאשר מגש החיץ יבש לחלוטין, מכסים אותו בנייר אלומיניום ומ מניחים את המגש באמבט הקרח. ממלאים את אמבט הקרח בקרח כתוש ושומרים על האמבטיה במינוס 20 מעלות צלזיוס עד ההכנה. לאחר מכן, יש לנגב את הרטט ואת סכין הגילוח עם 70%אתנול ולכייל את הרטט כדי למזער את התנודות האנכיות ואת הנזק לרקמות במהלך הליך ההחלפה.
מיד לאחר רכישת דגימת הרקמה, להסיר את הרקמה מן aCSF כולין הובלה לחתוך את כל החלקים השרופים של רקמה. חותכים משטח אחיד כדי להקל על ההדבקה של חתיכת הרקמה על צלחת הדגימה ולהשתמש ברטט כדי לחתוך את רקמת המוח לפרוסות בעובי 400 מיקרומטר, התאמת משרעת ומהירות הרטט לפי הצורך במהלך החיתוך. חלקים מסוימים של ההיפוקמפוס האנושי יכולים להיות עמידים יותר לחיתוך מאחרים.
נטילת טיפול נוסף ותזמן יכול לשפר מאוד את איכות המדגם. השתמש באזמל כדי לקצץ את פרוסות המוח כדי להתאים לתא ההקלטה ולהשתמש מרית מדפים קטנים כדי למקם בזהירות את הפרוסות על חתיכות קטנות של נייר מסנן בתא הממשק לפחות שעה אחת. עבור הקלטת פעילות אפילפטיפורם, מניחים קרום חדיר למחצה מודבק לטבעת פלסטיק לתוך התא ולחבר את צינורות הזרימה והזרימה של התא למשאבה פריסטלטית.
מלאו את הצינורות ואת התא ב-aCSF מחומם מראש. כדי להכין את האלקטרודות הקלטה, מילוי משך אחד עד שני פיפטות זכוכית megaohm עם 154 מילימולר נתרן כלורי פתרון. מניחים את הפיפטות במחזיק אלקטרודה ולהשתמש פינצטה ומרית להעביר פרוסת היפוקמפוס מתא הממשק לתוך צלחת פטרי מלא aCSF קרבוגניים.
מוציאים את נייר הסינון מבלי להפוך את הפרוסה ומ מניחים את הפרוסה בתא ההקלטה. החזק את הפרוסה במקום עם רשת פרוסה והצב את האלקטרודות באזור העניין. התחל את ההקלטה.
פעילות פרץ הנגרמת על ידי אשלגן גבוה בתוספת 4-aminopyridine צריך להיות גלוי שתיים עד חמש דקות לאחר לשטוף פנימה, בעוד אינדוקציה של אירועים דמויי התקף על ידי מגנזיום נמוך בתוספת bicuculline יכול לקחת עד 30 דקות. היישום של אשלגן גבוה בתוספת 4-aminopyridine גורם לפעילות אפילפטיפורם בצורה של אירועי פרץ בתוך כמה דקות. אירועים דמויי תפיסה עם משך של מעל 10 שניות יכול להיות המושרה עם היישום של מגנזיום נמוך בתוספת bicuculline.
מספר אירועי פרץ פוחת הן במהלך היישום של לקוסמיד ואת היישום של dimethylethanolamine, אם כי משרעת הם בעיקר מושפעים. ניתן לשפר גם את איכות רקמת המוח על ידי הפחתת הזיהום והנזק במהלך ההכנה. ניתן להשתמש בפרוסות מוח אנושיות המוכנות בשיטות שלנו גם כדי לחקור תפקודים פיזיולוגיים בסיסיים של נוירונים באמצעות מהדק טלאי או לחקור ביטוי גנים בטכניקות שונות.
מעבדות בכל רחבי העולם החלו לחקור מנגנונים בסיסיים בתוך המוח האנושי, ותובנות אלה יכולות לשמש כדי לסייע בפיתוח תרופות ו ניתן לבדוק אותן בשיטות המוצעות שלנו.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
