Login processing...

JoVE Journal
Bioengineering

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Bioengineering

Bruke magnetometry til å overvåke cellulær inkorporering og påfølgende biologisk nedbrytning av kjemisk synthetiserte jernoksid nanopartikler

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Journal (Bioengineering)

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H₃ 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Modulating Shape of Polyester Based Polymersomes using Osmotic Pressure

Journal (Bioengineering)

Modulating Shape of Polyester Based Polymersomes using Osmotic Pressure

Click here for the English version

Bruke magnetometry til å overvåke cellulær inkorporering og påfølgende biologisk nedbrytning av kjemisk synthetiserte jernoksid nanopartikler

Article DOI: 10.3791/61106-v

February 27th, 2021 •

Aurore Van de Walle¹, Anouchka Plan Sangnier^1,2, Alexandre Fromain¹, Claire Wilhelm¹, Yoann Lalatonne^2,3

¹Laboratoire Matière et Systèmes, Complexes MSC, UMR 7057, CNRS & University Paris Diderot, ²Université Sorbonne Paris Nord, Laboratory for Vascular Translational Science, LVTS, INSERM, UMR 1148, ³Services de Biochimie et Médecine Nucléaire, Hôpital Avicenne Assistance Publique-Hôpitaux de Paris

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

February 27th, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Jernoksid nanopartikler syntetiseres via en ikke-vandig sol gel prosedyre og belagt med anioniske korte molekyler eller polymer. Bruk av magnetometry for overvåking av inkorporering og biotransformasjoner av magnetiske nanopartikler inne i menneskelige stamceller er demonstrert ved hjelp av et vibrerende prøvemagnetometer (VSM).

Transcript

Denne videoen introduserer en rask og effektiv metode for syntese av magnetiske nanopartikler og bruk av magnetometri for å fotografere transformasjon i det biologiske miljøet. Magnetiske nanopartikler har tiltrukket seg økt oppmerksomhet for biomedisinske applikasjoner, Og det er viktig å forstå den skjebnen en gang internalisert i celler. Dette oppnås her ved å måle cellulær magnetisme.

For både magnetisk nanopartikler syntese og målinger kan resultatet påvirkes av forurensning. Bruk godt rengjorte kjemiske hetteglass og sørg for at magnetometerutstyret er uten forurensning. Magnetometriprøveholderen brukes vanligvis til pulverprøver.

Vi viser hvordan du tilpasser bruken av holderen til flytende eller biologiske prøver. I en 30 milliliter mana bølge glass hetteglass oppløse 400 milligram jern tre acetylacetonat i 10 milliliter benzylalkohol. Ved hjelp av en mikrobølgeovnreaktor, varme opp suspensjonen fra 25 grader Celsius til 250 grader Celsius med en hastighet på 11,25 grader Celsius per minutt, og opprettholde den på 250 grader Celsius.

For å skille nanopartiklene, påfør en neodymmagnet i 30 minutter. For å pellet nanopartiklene, utfør en rekke vasker ved hjelp av 10 milliliter av den angitte vaskevæsken og påfør en neodymmagnet i fem minutter. Fjern filtratet og tilsett 12 milliliter på 10 til minus to molarsyklorsyre.

Sentrifuger suspensjonen og et 100 kilodaltonfilter ved 2, 200 ganger G i 10 minutter. Deretter gjenbruker nanopartiklene i 10 milliliter på 10 til minus to molarsyklorsyre. Forbered beleggmolekylløsningen som beskrevet i manuskriptet.

Tilsett 10 milliliter nanopartikkel vandig dispersjon til beleggmolekylløsningen i et masseforhold på fem til en mellom beleggmolekylene og nanopartiklene. Deretter agiterer blandingen i to timer ved romtemperatur ved hjelp av en magnetisk rører. Etter at reaksjonen er fullført, juster pH av blandingen til syv ved hjelp av en molar natriumhydroksid.

Når kulturen av humane mesenchymale stamceller er ved passasje fem og 90% samløpet, fjern mediet og skyll cellene med serumfri RPMI uten glutamin. Til hver 150 kvadratcentimeter kulturkolbe, tilsett 10 milliliter nanopartikkelfjæring. Inkuber kolben ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 30 minutter.

Kast deretter mediet som inneholder nanopartikkelfjæringen og vask cellene én gang med serumfri RPMI 1640. Tilsett DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin streptomycin. Inkuber over natten ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid for å tillate fullstendig internalisering av nanopartiklene.

Tilsett 10 milliliter med 0,05% trypsin EDTA forutforfor i 37 grader Celsius til hver kolbe magnetisk merket MSCer. Etter to til tre minutter, når cellene er løsrevet, umiddelbart inaktivere trypsin ved å legge til en tredjedel av volumet av forhåndsvarsvart supplert DMEM. Sentrifuger de frittliggende cellene ved 260 ganger G i fem minutter.

Aspirer mediet og resuspend cellene i et lite volum celle-sfæroid kultur medium i en konsentrasjon på ca 200, 000 celler per 50 mikroliter. Tilsett en milliliter nylaget celle-sfæroid kultur medium til en 15 milliliter steril konisk sentrifuge rør. Legg deretter til et volum av celleuspensjon tilsvarende 200.000 celler.

Sentrifuge disse magnetisk merkede cellene ved 180 ganger G i tre minutter for å danne en cellepellet nederst på røret. Plasser deretter røret i inkubatoren ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid, og hold hetten litt åpnet for gassutveksling. Plasser enten et gitt volum av magnetisk nanopartikkel eller en fast enkeltcelle-sfæroid suspensjon i det vibrerende prøvemagnetometeret, eller VSM, prøveholder.

Om nødvendig kan PTFE-tape brukes til å forhindre lekkasje. Sett prøveholderen inn i VSM og søk etter prøveforskyvning. Plasser prøven i posisjonen som tilsvarer magnetiserings maximum.

Utfør den første målingen på et lavt magnetfelt mellom negative 1, 500 Oersteds og positive 1500 Oersteds med en hastighet på 20 Oersteds per sekund. Utfør en ny måling på et høyt magnetfelt mellom null Oersteds og positive 30.000 Oersteds med en hastighet på 200 Oersteds per sekund. 10 mikroliter nanopartikler spredt i en vandig løsning ble målt i det vibrerende prøvemagnetometeret.

Skråningen av den andre delen av kurven er den diamagnetiske konstanten, som representerer det diamagnetiske signalet fra vannet og prøveholderen. Denne diamagnetiske konstanten ble trukket fra det magnetiske øyeblikket av løsningen for å oppnå det magnetiske øyeblikket av nanopartiklene bare. Det magnetiske øyeblikket ved metning ble deretter bestemt.

Belagte nanopartikler ble internalisert i stamceller. Bilder av elektronmikroskop viser de citratbelagte og PAA-belagte nanopartiklene som er begrenset i endosomene. Etter at cellene ble pelleted av sentrifugering, dannet de en celle-sfæroid som kan holdes i kultur i lengre perioder.

Individuelle celle-sfæroider ble også målt ved hjelp av VSM og metning magnetisk øyeblikk ble brukt til å beregne mengden nanopartikler i en cellulær prøve. Opptak av nanopartiklene ble funnet å avhenge av inkubasjonskonsentrasjonen. En reduksjon i magnetisme av celle-sfæroider over tid indikerte biologisk nedbrytning av nanopartikler, som ble bekreftet av elektronmikroskopi.

Nedbrytningen var mer betydelig i de citratbelagte nanopartiklene enn i de PAA-belagte nanopartiklene. Ved hjelp av magnetometri kan nedbrytningen av magnetiske nanopartikler i celler nøyaktig kvantifiseres, og virkningen av nanopartiklers fremtid på interessert i rå atferd kan vurderes. I denne protokollen ble magnetometrimålingene utført på celle-sfæroider, men de kan utvides til celler til suspensjon eller til organer.

Med den beskrevne metoden kan du utforske samspillet mellom nydesignede magnetiske nanopartikler i forskjellige cellesystem av interesse, men også du kan følge deres in vivo biodistribusjon og skjebne.

X

Simple Hit Counter