Bioengineering
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Verwendung der Magnetometrie zur Überwachung der zellulären Inkorporation und des anschließenden biologischen Abbaus chemisch synthetisierter Eisenoxid-Nanopartikel
Chapters
Summary February 27th, 2021
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Eisenoxid-Nanopartikel werden über ein nicht wässriges Sol-Gel-Verfahren synthetisiert und mit anionischen Kurzmolekülen oder Polymeren beschichtet. Die Verwendung der Magnetometrie zur Überwachung der Integration und Biotransformation magnetischer Nanopartikel in menschlichen Stammzellen wird mit einem vibrierenden Probenmagnetometer (VSM) demonstriert.
Transcript
Dieses Video stellt eine schnelle und effiziente Methode zur Synthese magnetischer Nanopartikel und zum Einsatz von Magnetometrie zur Fotografie der Transformation in der biologischen Umgebung vor. Magnetische Nanopartikel haben erhöhte Aufmerksamkeit für biomedizinische Anwendungen angezogen, Und es ist wichtig zu verstehen, dass Schicksal einmal in Zellen verinnerlicht. Dies wird hier durch Messung des zellulären Magnetismus erreicht.
Sowohl bei der Synthese magnetischer Nanopartikel als auch bei Messungen könnte das Ergebnis durch Kontamination beeinflusst werden. Verwenden Sie gut gereinigte chemische Durchstechflaschen und stellen Sie sicher, dass die Magnetometer-Ausrüstung frei von Verunreinigungen ist. Der Magnetometrie-Probenhalter wird in der Regel für Pulverproben verwendet.
Wir zeigen, wie der Einsatz des Halters an flüssige oder biologische Proben angepasst werden kann. In einer 30 Milliliter Manawelle Glas durchalle40 Milligramm Eisen drei Acetylacetonat in 10 Milliliter Benzylalkohol auf. Mit Hilfe eines Mikrowellenreaktors wird die Suspension bei einer Geschwindigkeit von 11,25 Grad Celsius pro Minute von 25 Grad Celsius auf 250 Grad Celsius erhitzt und bei 250 Grad Celsius erhalten.
Um die Nanopartikel zu trennen, wenden Sie einen Neodym-Magneten für 30 Minuten an. Um die Nanopartikel zu pellet, führen Sie eine Reihe von Waschungen mit 10 Milliliter der bezeichneten Waschflüssigkeit und auftragen einen Neodym-Magnet für fünf Minuten. Entfernen Sie das Filtrat und fügen Sie 12 Milliliter von 10 zu den minus zwei Molsalzsäure.
Zentrifugieren Sie die Suspension und einen 100-Kilodalton-Filter bei 2, 200 mal G für 10 Minuten. Dann setzen Sie die Nanopartikel in 10 Milliliter n10 bis minus zwei Molsalzsäure aus. Bereiten Sie die Beschichtungsmoleküllösung wie im Manuskript beschrieben vor.
Fügen Sie die 10 Milliliter Nanopartikel wässrige Dispersion in die Beschichtungsmoleküllösung mit einem Massenverhältnis von fünf zu eins zwischen den Beschichtungsmolekülen und den Nanopartikeln hinzu. Dann rühren Sie das Gemisch für zwei Stunden bei Raumtemperatur mit einem Magnetischen Rührer. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, stellen Sie den pH-Wert des Gemischs mit einem Mol-Natriumhydroxid auf sieben an.
Wenn die Kultur der humanen mesenchymalen Stammzellen in Durchgang fünf und 90% konfluent ist, entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen mit serumfreiem RPMI ohne Glutamin ab. Zu jedem 150 Quadratzentimeter Großen Kulturkolben 10 Milliliter der Nanopartikelsuspension hinzufügen. Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 30 Minuten.
Dann entsorgen Sie das Medium, das die Nanopartikelsuspension enthält, und waschen Sie die Zellen einmal mit serumfreiem RPMI 1640. Fügen Sie DMEM ergänzt mit 10%FBS und 1%penicillin Streptomycin. Über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren, um eine vollständige Internalisierung der Nanopartikel zu ermöglichen.
Fügen Sie 10 Milliliter 0,05% Trypsin EDTA für 37 Grad Celsius zu jedem Kolben magnetisch beschrifteter MSCs hinzu. Nach zwei bis drei Minuten, wenn die Zellen abgetrennt sind, sofort inaktivieren das Trypsin durch Hinzufügen eines Drittels des Volumens der vorgewarnten ergänzten DMEM. Zentrifugieren Sie die abgetrennten Zellen bei 260 mal G für fünf Minuten.
Das Medium ansaugen und die Zellen in einem kleinen Volumen zellsphäroiden Kulturmediums in einer Konzentration von etwa 200.000 Zellen pro 50 Mikroliter wieder aussetzen. Fügen Sie einen Milliliter frisch zubereitetes Zellsphäroid-Kulturmedium zu einem 15 Milliliter sterilen konischen Zentrifugenrohr hinzu. Fügen Sie dann ein Volumen der Zellsuspension hinzu, das 200.000 Zellen entspricht.
Zentrifugieren Sie diese magnetisch beschrifteten Zellen drei Minuten lang bei 180 mal G, um ein Zellpellet am Boden des Rohres zu bilden. Dann legen Sie die Röhre in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, so dass die Kappe leicht für den Gasaustausch geöffnet. Legen Sie entweder ein bestimmtes Volumen magnetischer Nanopartikel oder eine feste einzelzellig-sphäroide Suspension in das vibrierende Probenmagnetometer oder VSM, Probenhalter.
Bei Bedarf kann PTFE-Band verwendet werden, um Leckagen zu verhindern. Legen Sie den Probenhalter in den VSM ein und scannen Sie nach Probenversatz. Platzieren Sie die Probe an der Position, die dem Magnetisierungsmaximum entspricht.
Führen Sie die erste Messung bei einem niedrigen Magnetfeld zwischen negativen 1, 500 Oersteds und positive m150 500 Oersteds mit einer Rate von 20 Oersteds pro Sekunde durch. Führen Sie eine zweite Messung bei einem hohen Magnetfeld zwischen null Oersteds und positiven 30.000 Oersteds mit einer Rate von 200 Oersteds pro Sekunde durch. 10 Mikroliter Nanopartikel, die in einer wässrigen Lösung dispergiert sind, wurden im vibrierenden Probenmagnetometer gemessen.
Die Steigung des zweiten Teils der Kurve ist die diamagnetische Konstante, die das diamagnetische Signal des Wassers und des Probenhalters darstellt. Diese diamagnetische Konstante wurde vom magnetischen Moment der Lösung subtrahiert, um nur das magnetische Moment der Nanopartikel zu erhalten. Das magnetische Moment bei der Sättigung wurde dann bestimmt.
Beschichtete Nanopartikel wurden in Stammzellen verinnerlicht. Elektronenmikroskopische Bilder zeigen die citratbeschichteten und PAA-beschichteten Nanopartikel, die in den Endosomen eingeschlossen sind. Nachdem die Zellen durch Zentrifugation pelletiert wurden, bildeten sie ein Zellsphäroid, das über einen längeren Zeitraum in Kultur gehalten werden kann.
Einzelne Zellsphäride wurden ebenfalls mit dem VSM gemessen und das magnetische Sättigungsmoment wurde verwendet, um die Menge der Nanopartikel in einer Zellprobe zu berechnen. Die Aufnahme der Nanopartikel hängt von ihrer Inkubationskonzentration ab. Eine Abnahme des Magnetismus der Zellsphäride im Laufe der Zeit deutete auf den biologischen Abbau der Nanopartikel hin, der durch Elektronenmikroskopie bestätigt wurde.
Der Abbau war bei den citratbeschichteten Nanopartikeln erheblicher als bei den PAA-beschichteten Nanopartikeln. Mit Hilfe der Magnetometrie kann der Abbau magnetischer Nanopartikel in Zellen genau quantifiziert und die Auswirkungen der Zukunft von Nanopartikeln auf das an Rohverhalten Interessierte bewertet werden. In diesem Protokoll wurden die Magnetometriemessungen an Zellsphäroiden durchgeführt, können aber auf Zellen zur Suspension oder zu Organen ausgedehnt werden.
Mit der beschriebenen Methode sind Sie in der Lage, die Wechselwirkungen von neu gestalteten magnetischen Nanopartikeln in verschiedenen Zellsystemvon Interesse zu erforschen, aber auch Sie können ihre in vivo Bioverteilung und Schicksal verfolgen.
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