Intra-arteriële levering van neurale stamcellen aan de Rat en Mouse Brain: Toepassing op cerebrale ischemie

Beroerte is de belangrijkste oorzaak van sterfte en invaliditeit wereldwijd. Hoewel trombose en chirurgische verwijdering van cerebrale vasculaire occlusie kan worden uitgevoerd bij bepaalde patiënten, zijn er nog steeds een dringende behoefte aan effectieve therapieën tegen een beroerte. Hier demonstreren we een katheter-gebaseerde, intra-arteriële levering van stamcellen aan het ischemische halfrond als een potentieel regime voor beroertetherapie.

Eerst introduceren we hoe we de injectiekatheter en chirurgische haken kunnen bereiden. We ontwierpen twee soorten injectiekatheters voor intra-arteriële injectie. Ontwerp een wordt gebruikt voor injectie van een oplossing of suspensie die niet hoeft te spoelen van de buis.

Ontwerp twee maakt injectie van neurale stamcellen mogelijk, gevolgd door een flush van het dode volume om het volledige volume te leveren. Voor het bouwen van een set injectiekatheters hebt u 26 meter en 20 meter naalden nodig, een lengte van 10 tot 15 centimeter van MRE 25 katheter en drie centimeter lengte van MRE 50 en MRE 10 katheters. Snijd zowel naald tips en polijsten het metalen uiteinde op schuurpapier om de buis te heropenen en glad de randen en vervolgens spoelen met gedestilleerd water schoon te maken van de boring en afwassen puin.

De figuur toont een gesloten uiteinde van een 20-meter naald na het afknippen van de naaldpunt, die na het polijsten met een gladde boring wordt heropend. Plaats onder een microscoop de 20-meter naald in het uiteinde van de MRE 50-slang. Buig de 26-meter naald en vervolgens doordringen in de slang onder het einde van de 20 meter naald tip.

Zet de 26-meter naald vast met superlijm. Dan insluiten de twee naald hubs en de slang en epoxy om een solide blok te bouwen om de sterkte te verbeteren. U zult ook drie chirurgische haken nodig hebben om het weefsel in positie te houden voor een betere blootstelling van de chirurgische plaatsen.

Snijd een anderhalve tot twee centimeter lange naaldschacht van een 27-meter naald en polijsten beide uiteinden op schuurpapier tot dof. Gebruik een kleine hemostatische klem om de schacht te buigen in een haak aan de ene kant en een ringvormige aan de andere kant. Steek een 10 tot 15 centimeter lange MRE 25 katheter door de ring en bevestig met duidelijke chirurgische tape.

Maak nog twee haken met dezelfde methode. De haken en katheter systeem moet ‘s nachts worden geweekt in zeventig procent ethanol voor sterilisatie. Alle procedures met betrekking tot dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Kentucky.

We gebruiken ENT embryonale muizenhersenen om GFP te kweken, positieve neurale stamcellen. GFP positieve embryo’s kunnen gemakkelijk worden gevisualiseerd in het FITC kanaal op een fluorescerende microscoop. Terwijl wild-type embryo’s tonen geen fluorescentie met dezelfde blootstelling.

De autofluorescentie van embryo’s van het wildtype is alleen zichtbaar wanneer de blootstellingstijd 100 keer wordt verhoogd. Embryonale cortex wordt verzameld en gebruikt om neurale stamcelculturen vast te stellen volgens het protocol van de fabrikant. Deze neurale stamcellen kunnen vormen neurosferen en kan worden passage over 10 generaties en ze kunnen onderscheiden in glia zijn neuronen.

Panel van embryonale stamcel markers zoals nanog, SSEA1, Oct4 en Sox3 kan worden gebruikt om de stamcel eigenschappen te identificeren, terwijl in neurosferen. Neurosferen werden gekweekt in de media, volgens het protocol van de fabrikant en het gebruik tussen passages drie en vijf voor neurale stamcellevering. Ischemische beroerte werd geïnduceerd in de linker hersenhelft voor zowel muizen als ratten, met behulp van een filament gebaseerd, middelste cerebrale slagader occlusie, MCAO met een aantal wijzigingen, afhankelijk van de soort.

Bij muizen wordt de gloeidraad ingebracht via de gemeenschappelijke halsslagader, CCA en gevorderd in de interne halsslagader, ICA. Terwijl bij ratten, de gloeidraad wordt geïntroduceerd via de externe halsslagader, ERK in de ICA vanwege de grotere werkruimte. Hier tonen we de muizenoperatie.

Na het maken van een middellijn incisie langs de nek, scheiden de onderliggende weefsels met behulp van stompe dissectie. Gebruik de drie microchirurgische haken gemaakt van naaldschachten met 27 meter om een beter gezichtsveld te bereiken. Het zwarte vierkant geeft het chirurgische gebied aan voor de volgende stap.

De spierlaag boven de linker CCA is zorgvuldig open om de linker CCA en nervus vagus bloot te leggen. Volg de CCA tot je de splitsing bereikt en identificeer je. Voorzichtigheid moet worden geboden om deze CCA- of vaguszenuw niet uit te rekken, te verplaatsen of te knijpen.

Open voorzichtig het heldere bindweefsel, dat de CCA- en nervus vagus bedekt. Maak de ruimte onder deze CCA vrij met een puntje van de tangen en isoleer de CCA-steel zo veel mogelijk. Rijg een dubbelstrengde zes O gevlochten nylon chirurgische hechting onder de CCA.

Snijd het middelste punt te laten om hechtingen die ten grondslag liggen aan de CCA. Plaats nog een nylon hechting onder de CCA. Bind een slipknot op de bovenste hechting, houd het los.

Scheid de twee onderste hechtingen. Bind een slip knoop met de middelste hechting, houden het los voor nu. Bind de knoop van een chirurg met een lagere hechting en verplaats deze zoveel mogelijk naar het proximale uiteinde.

Knip de hechtingseinden af. Verder bloot de CCA buiten de splitsing. Duw de bovenste losse slipknot naar de splitsing en draai deze aan om terugstroom van bloed te voorkomen.

Leg de siliconen rubber gecoate 70 nylon MCAO hechting naast de CCA. Snijd met behulp van een microschaar een kleine incisie op de CCA, naast de onderste knoop. Steek de punt van de MCAO hechting in de CCA door deze incisie en ga naar de bovenste knoop.

Pas de positie van de middelste knoop aan en draai deze aan totdat deze de MCAO-hechting op zijn plaats kan houden. Draai de knoop niet te veel aan. Laat de bovenste knoop los, maar maak op dezelfde locatie nog een losse slipknoop.

Advance de MCAO hechting in de ICA. Bevestig de MCAO hechting passeert de splitsing in de ICA. Het pad van de hechting moet relatief recht zijn, dieper in het weefsel terechtkomen naarmate het vordert.

Controleer de zilveren markering op het hechtingseind. Zorg ervoor dat het de splitsing bereikt. Controleer de richting van de MCAO hechting nog eens.

Pas de bovenste en middelste knopen aan om geen bloedlekkage te garanderen. Verdere vooruitgang de MCAO hechting, draai de twee bovenste knopen aan om de MCAO hechting op zijn plaats te beveiligen. Begin de opnametijd voor een uur ischemie.

Na een uur ischemie verdoven we het dier en heropenen we de huidwond. Stel het operatiegebied bloot. Zoek bovenste en middelste slipknots.

Laat voorzichtig de bovenste knoop los. Trek voorzichtig de MCAO hechting uit tot het witte siliconen rubberen deel de middelste knoop bereikt. Draai de bovenste knoop aan om de MCAO hechting op zijn plaats te houden om bloedingen te voorkomen.

Laat de middelste slipknot voorzichtig los. Trek de MCAO hechting tot het einde passeert de bovenste knoop. Draai de bovenste knoop aan.

Plaats de middelste slipknot recht boven de incisie op de CCA. Draai de middelste slipknot aan. Verwijder de bovenste knoop.

Trim hechteinden van de middelste knoop. Sluit de huidwond en laat het dier herstellen. Gebaseerd op onze ervaring, neurale stamcellen veilig geïnjecteerd via deze arteriële route tussen een en drie dagen na een beroerte.

Nogmaals, er zijn kleine variaties tussen muis en rat operaties voor neurale stamcelinjectie. En hier tonen we de muizenoperatie. Op dag drie na de beroerte verdooft u het dier, heropent u de wond en stelt u de CCA opnieuw bloot.

Leg een dubbelstrengde chirurgische hechting onder de CCA en snijd het in het midden om twee hechtingen te krijgen. Plaats de twee hechtingen goed. Maak een slipknot met de bovenste hechting.

Plaats het recht onder de splitsing. Draai de bovenste slipknot aan. Maak nog een slipknot met de middelste hechting.

Snijd een kleine incisie recht boven de bijgesneden knoop resterende van de beroerte chirurgie. Snijd de punt van de MRE 10 katheter met een hoek van ongeveer 45 graden. Gebruik dit scherpe uiteinde om de incisie op de CCA in te voeren.

Let erop dat de instaphoek en de kracht die wordt gebruikt om de katheter in te brengen, goed worden ingesteld. Anders mag de katheter de CCA niet binnenduken of doorboren. Steek de katheter in en ga door tot de punt de bovenste knoop bereikt.

Draai de middelste slipknot aan om de katheter op zijn plaats te houden en zorg voor geen bloedkoppeling. Laat de bovenste knoop los. Maak een slip knoop met de bovenste hechting.

Pas de hoek van de katheter in de CCA en de posities van beide knopen aan totdat een snelle terugstroom van bloed zichtbaar is, wat duidt op een succesvolle communicatie tussen de katheter en de CCA-stroom. Start de spuitpomp. Het bloed in de katheter wordt teruggespoeld in de CCA.

Beëindig de injectie na vijf minuten. Ligate de bovenste knoop. Laat de middelste knoop los en trek de katheter terug.

Ligate de middelste knoop. Knip alle knopen door. Sluit de wond en laat het dier herstellen.

Na intra-arteriële injectie, GFP gelabeld neurale stamcellen zijn meestal te vinden in de ipsilaterale hemisfeer. Hier tonen we de verdeling in de hippocampal dentate gyrus op een dag na injectie. In het ipsilaterale halfrond, sommige van de GFP positieve neurale stamcellen gelokaliseerd in de cortex en striatum, express dubbele cort, een marker van onrijpe neuronen.

Dit zijn representatieve beelden van schijn- en beroertedieren met of zonder neurale stamcelinjectie op zeven dagen na injectie. Na 30 dagen na de levering kan alleen kleine automatische fluorescentie worden gedetecteerd via het FITC-kanaal bij de dieren die een voertuiginjectie ontvangen. Terwijl in stamcellen geïnjecteerd dieren, GFP gelabeld neurale stamcellen kan worden gevonden in de gewonde hersenen met expressie van verschillende cel markers zoals de gleo marker GFP of de neuronale marker tujuan.

De witte pijlen in elke afbeelding geven neurale stamcellen aan die respectievelijk GFP- of tujuanmarkeringen uitdrukken. Tot slot, intra-arteriële injectie is een haalbare methode voor de levering van neurale stamcellen voor beroerte therapie. Neurale stamcellen kunnen overleven en differentiëren in verschillende celtypen binnen de gewonde hersenen.

En tenslotte kan de hier geïntroduceerde intra-arteriële injectiemethode ook worden gebruikt voor de levering van oplossingen en suspensies.