Environment
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Et gnotobiotisk system for å studere mikrobiomemontering i phyllosphere og i vegetabilsk gjæring
Chapters
Summary June 3rd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
En metode for voksende bakteriefrie Napa kål er utviklet som gjør det mulig for forskere å vurdere hvordan enkelt mikrobielle arter eller multispecies mikrobielle samfunn samhandler på kålbladoverflater. Et sterilt vegetabilsk ekstrakt presenteres også som kan brukes til å måle endringer i fellesskapssammensetning under vegetabilsk gjæring.
Transcript
Ved hjelp av denne protokollen kan vi ta opp viktige spørsmål om hvordan mikrober samles og samhandler i fyllosfæren. Den har den ekstra fordelen at ved å bruke det sterile grønnsaksekstraktet, kan vi knytte strukturen til phyllo sfæresamfunn til deres funksjon under vegetabilsk gjæring. Disse teknikkene gjør det mulig for forskere å teste hvordan mikrober samhandler i phyllo-sfæren og deretter spore hvordan disse phyllo sfæresamfunnene kan påvirke gjæring.
For å overflate sterilisere kålfrøene, start med å plassere 100 frø i et 1,5 milliliter mikro sentrifugerør. Tilsett en milliliter 70% etanol til røret og vortex det i fem minutter. Bruk deretter en pipette til å kaste etanol.
Tilsett en milliliter med 50% blekemiddel og vortex røret i fem minutter, og kast deretter blekemiddelet. Skyll frøene fire ganger, ved å legge til en milliliter autoklavet deionisert vann som virvler røret, og kast deretter vannet. Etter siste skylling, suge frøene i sterilisert deionisert vann i to til åtte timer for å myke frøfrakken før planting.
Vei 10 gram ren kalsiumleire i et 15 med 2,5 centimeter glassrør. Tilsett omtrent ni milliliter forberedt MS Bulth til hvert rør for å dekke kalsiumleire. Het glassrørene løst med 22 millimeter toveis testrørcaps.
Autoklav rørene ved 121 grader Celsius i 60 minutter. Når du fjerner rørene fra autoklaven, skyv hettene på glassrørene for å forsegle dem, og avkjøl deretter rørene til romtemperatur før bruk. Når rørene er avkjølt, brukte ekstra lange tang for å forsiktig plassere ett sterilt kålfrø i midten av hvert rør.
Snøre rørene i et syvveis brett og legg brettet under lysstativer med en 16 timers lyssyklus ved 24 grader Celsius. Frøene vil utvikle sitt første sanne blad etter fem dager, som er det første vaskulære bladet etter at cotyledons har dannet seg. Den har en rynkete kant og er dekket av tricombs.
For å teste bakteriefri kål for sterilitet, ta forsiktig tak i plantens base med steriliserte tang og trekk den ut. Før du fjerner kålen helt fra røret, kutt forsiktig av røttene med sterilisert disseksjonsaks. Deretter komprimerer kålbladene til et 1,5 milliliter mikro sentrifugerør.
Tilsett 400 mikroliter PBS til hvert mikrosentridrifugerør og bruk en steril mikropesempel for å homogenisere kålen. Blad 100 mikroliter av kål homogenate på agar plater, sørg for å bruke en bred åpning pipette tips. For å lage glyserollagre av inokuleringsstammer, fjern forsiktig ut individuelle kolonier på to eller tre nye plater av samme media.
Ro koloniene i to til fem dager, og skrap dem deretter fra platene til et 15 milliliter konisk rør med 15 milliliter 15% glyserol. Vortex røret grundig for å blande. Aliquot en milliliter av blandet glyserol lager i en mikro sentrifuge rør og lagre den 80 grader Celsius til klar til bruk sammen med de resterende 14 milliliter av glyserol lager.
En uke før bruk tiner du den ene milliliter aliquot på is og plasserer den på flere forskjellige fortynninger for å bestemme konsentrasjonen av inokulasjonsbestanden. Når du er klar til å inokulere kålen, tin glyserolbestanden på is og fortynne den til ønsket konsentrasjon. Tilsett 10 milliliter av den fortynnede bestanden til den sterile pumpeflasken og pump fem sprayer i et stort avfallsoppsamlingsbeger.
Fjern lokket fra kålrøret og vipp kålen mot sprayflasken. Spray hver kål med tre pumper av inokulasjonsløsningen, og høst deretter en undergruppe av kålene for å vurdere den faktiske inngangs inokulasjonskonsentrasjonen. For å høste kålen, fjern den fra røret med steriliserte tang.
Klipp av røttene med steril disseksjon saks og legg den forsiktig i en pre veid steril mikro sentrifuge rør. Registrer vekten av kålen for fremtidige beregninger. Tilsett 400 mikroliter PBS til hvert rør med kål og slip den 30 ganger med en mikro pestle, og legg deretter kålhomogenatet ved hjelp av brede åpningpipettespisser.
Fjern og kast kålens ytterste blader og hakk all gjenværende kål for å passe inn i en blender. Bland den til en fin masse og vei kålhomogenatet. Tilsett to milliliter destillert vann per gram kål.
Deretter filtrerer kålslamen gjennom to lag med kurvkaffefiltre. Dispenser slammet i sentrifugerør og sentrifuger den ved 20 000 ganger G i 20 minutter eller til store partikler legger seg ut av oppløsning. Fjern det overnaturlige, og ta vare på å ikke forstyrre pelleted kålrester.
For å gjenskape gjæringsforholdene med standard saltkonsentrasjoner, tilsett 2% vekt til volumnatriumklorid til ekstraktet. Bilder grønnsaksekstraktet med et 0,2 mikrometerfilter festet til et vakuum, dispenser det i sterile rør og frys det på minus 80 grader Celsius. Frøsteriliseringsmetoden ble testet med flere Napa kåler, og de viste alle lignende vekstrater.
Men andre arter av brassica ga begrenset suksess fordi plantene enten hadde lave spiring priser etter sterilisering eller stammen langstrakt raskt for å lage en spindly usunn plante. Mikrobielle isolater ble vaksinert enten som enkeltbelastningisolerer eller i kombinasjon med en annen isolat. Totalt 15 bakteriefrie kåler ble testet for hver behandling og høstet enten umiddelbart, på fire dager eller ved 10 dager etter inokulasjon.
Isolatene viste rask vekst i Napa kål Phyllosphere. To gjær og tre bakterier ble inokulert i tre forskjellige typer sterile vegetabilske ekstrakt eller SVE laget av rød, grønn og Napa kål. Veksten av inokulene ble registrert over 14 dager ved å oppdage fem mikroliter av hver behandling på enten MRS eller YPD agar plater.
Målinger av pH gjennom gjæringen viste at melkesyrebakteriene var i stand til å forsure SVE til nivåer under pH fire, noe som indikerer en gjæring som er trygg for forbruk. Disse metodene har spesielt brukt på kålmikrobiomet, men kan være nyttig i andre plantesystemer. Det kan være utfordrende å holde systemet sterilt, våre disposisjonsprotokoller er detaljerte, men vi fant hvert trinn for å være viktig.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
