In Vivo Målretting av Nevrale stamceller i Ferret Neocortex av In Utero Electroporation

Denne protokollen tillater oss å utføre en genetisk manipulasjon in vivo i en viktig dyremodell som tillater oss å studere utvidelsen og folding av en utviklende neocortex. Den største fordelen med denne metoden er å bruke høy romlig og timelig spesifisitet i å målrette de nevrale stamcellene som er nøkkelcelletypen for hjerneutvikling. Før du begynner prosedyren, trekk glasskapillærer på en mikropipettetrekker og bruk tang til å kutte av den distale delen av kapillæren for å justere diameteren på kapillærspissen.

På embryonisk dag 33, tilsett riktig konsentrasjon av DNA i PBS, supplert med 0,1% Fast Green med mild blanding, og plasser en 3-timers fastet, bedøvet, gravid kvinnelig ilder på et operasjonsbord med en varmepute. Bekreft riktig nivå av sedasjon ved å berøre den periocular huden og klemme huden mellom andre og tredje eller tredje og fjerde tærne på begge baklemmer. Isofluran kan forårsake bivirkninger, inkludert kvalme og svimmelhet.

Bruk verneutstyret ved håndtering av isofluran i flytende form. Under operasjonen, bruk passende beholdere for å fange gassen. Injiser dyret subkutant med smertestillende, antibiotika og glukose, og legg salve på dyrets øyne.

Bruk klippere til å barbere magen, og rengjør den eksponerte huden med en vann-, såpe- og jodoppløsning. Tørk deretter huden med gasbindvattpinner og desinfiser med alkohol og jodskrubb. For in utero elektroporasjon, plasser en steril drapering over dyret og bruk en skalpell for å lage et ca 5-centimeter hud snitt på linea alba.

Bruk saks for å skjære gjennom muskellaget og plassere gasbind vattpinner rundt snittstedet. Våt gasbind med PBS og plasser livmoren på vattpinnene. Bruk en pipette med en lang spiss, legg i en av de trukket glasskapillærer med 5 mikroliter DNA-løsning per embryo som skal injiseres.

Fest den ladde kapillæren til en holder og koble den andre siden av holderen til et rør og et munnstykke. Finn hodet til det første embryoet og plasser en fiberoptisk lyskilde ved siden av hodet. Bruk pigmentert iris som referansepunkt, trenge inn i huden, skallen og hjernevevet med spissen av glasskapillæren og bruk munnpipettering for å lette leveringen av 3-5 mikroliter av injeksjonsoppløsningen i ventrikkelen på en av de cerebrale halvkulene.

Fordi den injiserte oppløsningen inneholder 0,1% Fast Green, vil en vellykket injeksjon resultere i en mørk grønn farging av injisert ventrikkel, som nå vil være synlig som en nyreformet struktur. Etter injeksjonen, plasser pinsettelektrodene på livmoren over embryoets hode med den positive stangen over området som skal målrettes og den negative polen under det injiserte området. Sett pulslengden på elektroporatet til 50 millisekunder, pulsspenningen til 100 volt, pulsintervallet til ett sekund, og antall pulser til fem.

Når alle parametrene er satt, trykk Pulse”og slipp raskt flere dråper varm PBS på det elektroporerte embryoet. Når alle embryoene er elektroporert, returnere livmoren til bukhinnen og bruk en 4-0 sutur for å lukke muskellaget med bukhinnen. Lukk huden på en lignende måte og dekk såret med aluminiumspray.

Deretter returnerer du dyret til buret med en varmekilde og overvåker til full recumbency. Fire dager etter elektroporasjon på embryonisk dag 37, er de fleste av de målrettede cellene og deres avkom fortsatt i germinal sonene, og cellene observeres sjelden ytterligere basalt innenfor kortikalplaten. Stamfaridentiteten kan undersøkes ved immunsvikt for markører av sykkelceller, som PCNA, mens en undergruppe av stamfar som gjennomgår mitose kan vises av markører som fosfo-histone 3.

På postnatal dag null, åtte dager etter elektroporasjon, spredte avkom av de målrettede cellene seg til alle histologiske lag. Ved hjelp av en kombinasjon av transkripsjonsfaktormarkører kan forskjellige basale stamcellepopulasjoner avsløres. For eksempel er Sox2 en markør for proliferative stamceller, inkludert basal radial glia.

Og T-box hjerneprotein 2 er en markør for nevrogene basalstamfarer, som hovedsakelig er mellomliggende forfedre. Ved postnatal dag 16 slutter et flertall av de målrettede cellene å dele seg og differensiere seg i nevroner og glia, med ilder postnatal dag 16 neocortex som viser det karakteristiske foldemønsteret. In utero elektroporasjon av ilderembryoer er en ekstremt kraftig metode for å studere geners funksjon.

Det har gjort det mulig for oss å studere gener som har vært innblandet i utvidelsen av neocortex i evolusjon, inkludert menneskespesifikke gener. Og ved hjelp av denne kraftige metoden har vi faktisk vært i stand til å finne ut viktige funksjoner i hvordan den evolusjonære utvidelsen av den menneskelige neocortex sannsynligvis fungerte.