Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
В Vivo Ориентация нейронных клеток-предшественников в Ferret Neocortex от In Utero Electroporation
Chapters
Summary May 6th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Здесь представлен протокол для выполнения генетических манипуляций в эмбриональном мозге хорька с использованием в утробе матери электропорации. Этот метод позволяет таргетирование нейронных клеток прародителя в неокортексе in vivo.
Transcript
Этот протокол позволяет нам выполнять генетические манипуляции in vivo в ключевой модели животных, что позволяет нам изучать расширение и складывание развивающегося неокортекса. Основным преимуществом этого метода является использование высокой пространственной и временной специфичности в ориентации на те нервные стволовые клетки, которые являются ключевым типом клеток для развития мозга. Перед началом процедуры, тянуть стеклянные капилляры на микро пипетки шкив и использовать типсы, чтобы отрезать дистальной части капилляра, чтобы настроить диаметр капиллярного кончика.
На эмбриональный день 33, добавить соответствующую концентрацию ДНК в PBS, дополненный 0,1%Быстрый зеленый с нежным смешивания, и место 3-часовой пост, анестезировал, беременная самка хорька на столе операции с тепловой площадкой. Подтвердите соответствующий уровень седиации, касаясь периокулярной кожи и щипать кожу между вторым и третьим или третьим и четвертым ног обеих задних конечностей. Изофлюран может вызвать неблагоприятные последствия, в том числе тошноту и головокружение.
При обработке изофлюран в жидком виде используйте защитное оборудование. Во время операции используйте соответствующие канистры для захвата газа. Вводите животному подкожно анальгетики, антибиотики и глюкозу, и поместите мазь на глаза животного.
Используйте клиперы для бритья живота и очистки открытой кожи водой, мылом и раствором йода. Затем высушите кожу марлевыми тампонами и продезинфицируете спиртом и йодными скрабами. Ибо в утробе матери электропорации, место стерильной драпировки над животным и использовать скальпель, чтобы сделать примерно 5-сантиметровый разрез кожи на линии Альба.
Используйте ножницы, чтобы прорезать мышечный слой и разместить марлевых тампонов вокруг места разреза. Влажная марля с PBS и поместите матку на тампоны. Используя пипетку с длинным наконечником, загрузите один из вытянутых стеклянных капилляров с 5 микролитров раствора ДНК на эмбрион, которые будут введены.
Прикрепите загруженную капиллярную часть к держателю и соедините другую сторону держателя с трубкой и мундштуком. Найдите головку первого эмбриона и поместите источник волоконно-оптического света рядом с головой. Используя пигментированную радужную оболочку в качестве точки отсчета, проникайте в кожу, череп и мозговую ткань кончиком стеклянной капиллярной артерии и используйте трубу рта для облегчения доставки 3-5 микролитров инъекционного раствора в желудочек одного из полушарий головного мозга.
Поскольку инъекционный раствор содержит 0,1%Fast Green, успешная инъекция приведет к темно-зеленому окрашивания инъекционного желудочка, который теперь будет виден как почечная структура. После инъекции поместите электроды пинцета на матку над головой эмбриона с положительным полюсом над областью, которая будет направлена и отрицательный полюс ниже вводили области. Установите длину импульса электропората до 50 миллисекунд, импульсное напряжение до 100 вольт, интервал импульса до одной секунды и количество импульсов до пяти.
Когда все параметры будут установлены, нажмите Пульс "и быстро падение несколько капель теплого PBS на электропогрятый эмбрион. Когда все эмбрионы были электропотери, вернуть матку в брюшной полости и использовать 4-0 шва, чтобы закрыть мышечный слой с брюшной полости. Закройте кожу аналогичным образом и накройте рану алюминиевым спреем.
Затем вернуть животное в клетку с источником тепла и мониторинга до полного лежачих. Через четыре дня после электропорации в эмбриональный день 37, большинство целевых клеток и их потомство все еще находятся в зародышевых зонах и клетки редко наблюдаются дальше базально в корковой пластине. Личность прародителя может быть исследована с помощью иммунофторенса для маркеров велосипедных клеток, таких как PCNA, в то время как подмножество прародителей, проходящих митоз, может быть показано маркерами, такими как фосфо-гистон 3.
На послеродовой нулевой день, через восемь дней после электропорации, потомство целевых клеток распространилось на все гистологические слои. Используя комбинацию маркеров транскрипционного фактора, могут быть выявлены различные популяции базальных прародителя. Например, Sox2 является маркером пролиферативных клеток-предшественников, включая базальные радиальные глии.
А белок мозга T-box 2 является маркером нейрогенных базальных прародителей, которые в основном являются промежуточными прародителями. К послеродовому 16-му дню большинство целевых клеток перестают делиться и дифференцироваться на нейроны и глию, при этом хорек послеродового дня 16 неокортекс демонстрирует характерный складной узор. В утробе матери электропорации эмбрионов хорька является чрезвычайно мощным методом для изучения функции генов.
Это позволило нам изучить гены, которые были вовлечены в расширение неокортекса в эволюции, в том числе человеческих генов. И с помощью этого мощного метода, мы действительно смогли выяснить ключевые особенности того, как эволюционное расширение неокортекса человека, вероятно, работал.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
