Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish
Chapters
Summary May 8th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier beschreven is een methode voor het gebruik van zebravis embryo's om het vermogen van gefunctionaliseerde nanodeeltjes te bestuderen om menselijke kankercellen in vivo richten. Deze methode maakt de evaluatie en selectie van optimale nanodeeltjes mogelijk voor toekomstige tests bij grote dieren en in klinische proeven.
Transcript
Deze procedure stelt onderzoekers in staat om optimale nanodeeltjes te evalueren en te selecteren voor studies bij grote dieren en klinische proeven. Deze eenvoudige methode helpt bepalen of de nanodeeltjes kan richten op de menselijke kankercellen in vivo en zo ja, hoe efficiënt de targeting is. Het aantonen van de procedures zal Dr.Xiodan Qin, een postdoc, en de heer Andrew Lam, een onderzoekstechnicus van ons lab.
Vul 's avonds twee kamerparingtanks met viswater en scheid de bovenste tanks met verdelers. Plaats een mannelijke zebravis in de ene kant van de kamer en een of twee vrouwtjes zebravis in een andere kant van de kamer. Verwijder de verdelers om 8:00 uur de volgende ochtend.
Voeg kunstmatige verrijkingsinstallaties toe en kantel de bovenste kamer iets om een ondiep gebied van water te creëren. Laat de zebravis drie tot vier uur broeden en verzamel de eieren uit de onderste kamer door het water door een gaasnet te gieten. Breng de eieren naar een petrischaaltje met niet meer dan 200 eieren per gerecht.
Verwijder dode of onbevruchte eieren. Vul de schotel twee derde vol met vers viswater en plaats het in de couveuse. Haal na 24 uur de schaal uit de couveuse en haal zoveel mogelijk water uit de schaal.
Voeg een paar druppels van een milligram per milliliter pronaza oplossing en zachtjes wervelen de schotel. Wanneer de chorions tekenen van desintegratie vertonen, pipette de embryo's op en neer een paar keer af te breken de chorions en laat de embryo's. Zodra de meerderheid van de embryo's uit de chorions zijn, voeg onmiddellijk vers viswater toe om het proces te beëindigen.
Spoel de embryo's drie keer met viswater om de drijvende chorions te verwijderen Breng de embryo's terug naar de couveuse. Maak een 3%agarose oplossing door het toevoegen van drie gram elektroforese-grade agarose tot 100 milliliter autoclaved viswater. Microgolf agarose en water tot de agarose volledig wordt opgelost.
Om de injectieplaat te maken, giet hete agarose oplossing in een petrischaaltje totdat het driekwart vol is en plaats de micro-spuitgietmatrijs op de agarose. Nadat de agarose is gestold, verwijder voorzichtig de mal. Vul de resulterende injectieplaat met autoclaved viswater en bewaar het op vier graden Celsius.
Om de injectienaalden te maken, trekt u de glazen haarvaten van 0,78 millimeter aan een pipettrekker met een oppervlakte van 0,78 millimeter. Bewaar de injectienaalden op stopverf in een grote petrischaal die is afgeveegd met een ethanolhanddoek. Voordat u de HeLa-cellen oogst, warmt u de injectieplaat en het viswater in de couveuse op bij 35,5 graden Celsius.
30 minuten tot een uur voor de transplantatie, oogst de HeLa cellen. Werken in een weefsel cultuur kap, verwijder het medium uit de kolf door aspiratie. Spoel de cellen met steriele PBS om alle sporen van het medium te verwijderen.
Voeg drie milliliter steriele trypsine EDTA toe aan de kolf en broed het drie tot vijf minuten in op 37 graden Celsius. Observeer de kolf onder de microscoop om de voortgang van enzymatische spijsvertering te volgen. Wanneer ongeveer 80% van de cellen worden opgeschort, voeg zes tot acht milliliter groeimedium toe aan de kolf.
Verzamel de cellen door zachtjes te pipetten en breng ze over naar een 15 milliliter steriele buis. Centrifuge de buis op 135 keer G gedurende vijf minuten. Aspirate de supernatant en resuspend de HeLa cellen in drie milliliter van volledige groei medium.
Na het tweemaal herhalen van de wasstappen, de cellen opnieuw opsuspenen in één milliliter van volledig groeimedium. Tel vervolgens de cellen onder de microscoop met behulp van een hemocytometer. Na het centrifugeren van de cellen opnieuw, verwijder de supernatant.
Resuspend de cellen in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis bij een concentratie van vijf keer 10 tot de zevende cellen per milliliter. Houd de cellen warm door de buis in één hand te houden bij het transport naar de visfaciliteit. Plaats met behulp van een plastic pipet de embryo's van zebravissen op de injectieplaat.
Leg embryo's op hun zijkanten met het voorste naar voren gericht op de groeven op de plaat. Zet de luchtbron en de micro-injector aan. Na het ophalen van de HeLa cellen uit de incubator, pipette de cellen op en neer 20 tot 30 keer met behulp van een P200.
Met behulp van een gel laadpunt met een gesneden uiteinde, onmiddellijk laden drie microliters van de HeLa cel suspensie in een van de injectienaalden. Steek de naald in de naaldhouder en plaats de injectieplaat onder de microscoop. Injecteer het celmengsel in het embryo op het gevasculariseerde gebied onder de perivitellineholte door op het voetpedaal te drukken.
Dan pipette een paar druppels steriel viswater op het embryo. Om het injectieproces voort te zetten, gebruikt u de niet-dominante hand om de injectieplaat naar het volgende embryo te verplaatsen en vervolgens de dominante hand te gebruiken om de injector uit te breiden en in te trekken terwijl u tegelijkertijd op het voetpedaal drukt. Werk de injectie van alle embryo's op het bord af en was de embryo's met steriel viswater in een steriel petrischaaltje.
Onmiddellijk incubeer de schotel op 35,5 graden Celsius. Na drie uur, onderzoek de geïnjecteerde embryo's en verwijder de dode. Maak de volgende dag injectienaalden voor de nanodeeltjes en bewaar ze op stopverf in een grote petrischaal.
Werken onder een fluorescerende microscoop, zorgvuldig pick-up embryo's met staart uitzaaiingen en leg ze op een nieuwe injectieplaat met steriel viswater. Voor elke zebravis met een staartmetastase, injecteer ofwel nano-deeltje oplossing of water achter het oog. Injecteer ook nanodeeltjesoplossing achter de ogen van de zebravis in de controlegroep die geen HeLa-transplantaties heeft ondergaan en alle geïnjecteerde embryo's bij 35,5 graden Celsius heeft geïncubeerd.
Onmiddellijk na de injectie en opnieuw met intervallen van 30 tot 60 minuten, breng twee tot drie embryo's naar een petrischaaltje en immobiliseer ze door vijf druppels verdunde MS222-oplossing toe te voegen. Zodra de embryo's stoppen met zwemmen, verwijder het grootste deel van het water om de embryo's te laten liggen op hun zijkanten. Met behulp van een pipet met een dunne zachte borstel bevestigd aan het einde, lijn de embryo's, zodat ze liggen met de voorste naar voren en slechts een oog zichtbaar.
Met behulp van 2x vergroting, leg beelden van het hele embryo op rode, blauwe en Brightfield kanalen. Om het staartgebied vast te leggen, beeldt u de embryo's bij 6,4x vergroting. Focus het embryo onder het rode kanaal om het bloeden van nanodeeltjes te voorkomen.
Voeg onmiddellijk na beeldvorming vers viswater toe aan de embryo's en breng ze terug naar de couveuse. Geïnjecteerd en controle zebravis embryo's werden afgebeeld met behulp van een fluorescerende microscoop. De rode stippen zijn uitgezaaide menselijke baarmoederhalskankercellen, terwijl de blauwe stippen de nanodeeltjes vertegenwoordigen.
In één controlegroep waren zebravissen die werden geïnjecteerd met kankercellen, maar niet met nanodeeltjes, fluorescerende HeLa-cellen zichtbaar in het rode kanaal en werden er geen specifieke fluorescerende signalen gedetecteerd in het blauwe kanaal. In de andere controlegroep werden zebravissen geïnjecteerd met nanodeeltjes, maar niet met kankercellen. Blauwe fluorescerende nanodeeltjes werden verspreid over de bloedsomloop.
Er was geen specifieke rode bloeiwijze zichtbaar. Wanneer zebravissen met staartmetastasen werden geïnjecteerd met nanodeeltjes, tonen bedekte beelden van de rode en blauwe kanalen co-lokalisatie van HeLa-cellen en nanodeeltjes. Na het uitvoeren van deze methode, kunnen we analyseren tumorlast en kankercel overleving, de dieren met en zonder injecteren nano-deeltjes om hun vermogen van het doden van kankercellen aan te passen.
Deze techniek kan de selectie van het optimale nanodeeltje vergemakkelijken dat specifiek de kankercel in vivo kan herkennen, wat leidt tot vroegtijdige opsporing van kanker en kankermetastase.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
