Biology
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使用光可转换的登德拉2，在老化的蛋白质周转量中，在体内C.Elegans
Chapters
Summary June 13th, 2020
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这里介绍的是一个协议，用于监测蛋白质亨廷顿蛋白的降解，该蛋白与光可转换的荧光素Dendra2有关。
Transcript
该协议允许跟踪和定量对活和老化的C.elegans感兴趣的蛋白质的降解。这种体内和非侵入性技术只需要很少的显微镜设置，以可靠地将Dendra2转化为明亮和稳定的荧光。该方法适用于哺乳动物系统以及斑马鱼。
研究，把营业额在原型统计网络以及运输和贩运。使用蓝光激光扫描时，注意不要引发不需要的 Dendra2 转换，并测试和优化每个系统和融合蛋白的采集设置和转换设置。从在20摄氏度下将年龄匹配的线虫长到实验所需的年龄开始。
在成像实验当天，在双蒸馏水中以3%浓度熔化一般品位的阿加罗斯。当气糖冷却时，切开一毫升移液器尖端，以方便吸入大约 400 微升的熔化气液。小心地在干净的玻璃滑梯上添加几滴阿加糖，并立即将另一张幻灯片放在水滴的顶部，在两个玻璃片之间形成一个薄薄的阿加糖垫。
当加糖干燥时，小心地拆下顶部滑轨。准备好足够的幻灯片后，打开共和显微镜软件，并设置激发和发射光路。对于绿色 Dendra2 添加 486 到 553 纳米，对于红色 Dendra2 添加 580 到 740 纳米。
根据荧光团的强度调整两个通道的功率和增益，将针孔完全打开。选择顺序通道模式并设置轨道以切换每个帧。将扫描模式设置为帧，帧大小设置为 1024 by 1024，线步数为 1。
将平均值设置为 2，通过单向线的均值方法和模式将平均值设置为平均值。将位深度设置为 8 位。定义用于 Dendra2 转换的多维采集设置。
对于转换和漂白，请使用 405 纳米二极管激光器设置为 60% 的能量功率。选择两个周期的时间序列，周期之间间隔为 0.0 毫秒，并且正常启动和停止。将漂白设置为扫描后开始两个之一，重复 30 次迭代，并在强度降至 50% 时停止，然后，定义采集像素停留速度以快速进行转换，并定义介质以捕获快照图像。
要将线虫安装到幻灯片上，请使用永久标记绘制每个幻灯片上的 agarose 垫对面的窗口，并编号四个方块。将 15 微升的 levamisole 添加到 agarose 垫的中间，并使用立体显微镜和线挑将年龄匹配的线虫转移到液滴中。使用睫毛选择轻轻地将每个线虫移动到正方形的一个窗口中。
当所有线虫都重新定位后，等待蠕虫停止移动，然后再在液体上放置盖滑，以在成像过程中固定线虫。然后，将幻灯片放在共合显微镜舞台上。对于绿色 Dendra2 转换，请使用绿色荧光下 20 X 目标的目镜定位第一线虫并聚焦在头部或尾部。
切换到共和模式，增加或减少增益和激光功率，以获得饱和但不会过度曝光的图像。在所选神经元周围绘制一个感兴趣区域，并在尾部周围绘制第二个较大的感兴趣区域，其中包括第一个感兴趣区域。设置要获取、漂白和分析的第一个区域。
设置要获取和分析的第二个感兴趣区域，但不得漂白。将扫描速度设置为最大值，并开始扫描以转换选定的 Dendra2 神经元。转换后，立即开始使用绿色 561 纳米激光进行实时扫描，以在红色通道中可视化 Dendra2，并找到转换神经元的焦点和最大投影。
快速将扫描速率设置为较低的像素驻用速度，以更高的分辨率获取两个通道的快照图像。此图像在转换后的时间为零。然后，使用可识别的名称和或数字保存扫描，然后保存时间零标签。
要跟踪 Dendra2 随时间而退化，请打开相应线虫神经元的时间零图像。使用相同的图像设置，开始实时扫描红色通道，并将转换后的红色神经元聚焦。然后，在不更改任何采集参数的情况下，以与第一个图像相同的速度获取快照。
请务必仔细定义转换设置，以便高效、充分地转换 Dendra2，并在整个不同时间点中保持相同的采集参数。要分析转换后的 Dendra2 图像，请打开斐济的时间零点和第二个时间点图像，然后打开"分析和设置测量"。选择"面积"和"集成密度"功能，然后选择使用红色通道获得的图像。
使用多边形选择工具，在零转换神经元的时间周围绘制一个感兴趣区域。要正确识别神经元的轮廓，请选择"图像、调整"和"阈值"以突出显示强度阈值。定义选择后，单击"分析和测量"。
将显示一个弹出结果窗口，包括所选感兴趣区域的区域、集成密度和原始集成密度值。从第二个时间点对图像执行相同的选择和测量过程。然后，将值复制到电子表格中。
在转换前的此代表性分析中，当样本在红色通道中兴奋时，看不到红色信号。辐照后，绿色信号随着HTT-D2的转换而减弱，随后出现红色信号。HTT-D2表达会随着时间而下降，导致红色HTT-D2信号水平降低，绿色HTT-D2信号可能随着新合成更多的融合蛋白而增加。
值得注意的是，与头部神经元相比，尾部区域的神经元明显更活跃。此外，在转换后24小时，头部和尾部神经元的控制HTTQ25-D2明显退化。然而，在致病性HTTQ97-D2中未观察到这种差异，这表明蛋白位虫网络无法去除含有较长谷氨酸的HTT-D2在整个神经系统中延伸。
HTTQ97-D2在非常古老的线虫中并没有像HTTQ25-D2那样有效降解，这突出地突出了蛋白虫网络无法去除较老动物中可能有毒的亨廷顿蛋白的聚合和可能有毒的物种。重要的是，尾部神经元能够应对年轻线虫中的有毒HTTQ97-D2，这表明各种伴随蛋白细胞网络机制可能正在工作，以消除HTT-D2。对于每个样本，在转换后立即获取和未过度曝光和非饱和图像，并在整个时间重复使用该样本的相同设置。
有了这个协议，可以测试蛋白质统计网络的变化，还可以在超分辨率显微镜的帮助下，跟踪疾病相关蛋白质的传播。
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