In Vivo Kvantifiering av proteinomsättning i åldrande C. Elegans med photoconvertible Dendra2

Detta protokoll möjliggör spårning och kvantifiering av nedbrytningen av ett protein av intresse för levande och åldrande C.elegans. Denna in vivo och noninvasive teknik kräver endast lite mikroskopi inrättas för att tillförlitligt omvandla Dendra2 till en ljus och stabil fluorophore. Metoden är anpassningsbar till däggdjurssystem, samt zebrafisk.

Att studera, sätta i omsättning inom proteostatisnätverket samt transport och trafficking. Var noga med att inte provocera oönskad konvertering av Dendra2 medan du skannar med den blå ljuslasern, och för att testa och optimera förvärvsinställningarna och konverteringsinställningarna för varje system och fusionsprotein. Börja med att växa åldersmatchade nematoder vid 20 grader Celsius till önskad ålder för experimentet.

På dagen för bildframställning experiment, smälta allmän kvalitet uppstod vid en 3%koncentration i dubbel destillerat vatten. Medan agaros kyler, skär spetsen på en en milliliter pipett spets för att underlätta aspiration av cirka 400 mikroliter av den smälta agaros. Tillsätt försiktigt några droppar agaros på en ren glasrutschkana och placera omedelbart en annan bild ovanpå dropparna för att skapa en tunn dyna av agaros mellan de två glasbitarna.

När agaros har torkat, försiktigt bort den övre bilden. När tillräckligt med diabilder har förberetts, öppna konfokalmikroskop programvara och ställa in ljusvägen för excitation och utsläpp. För grön Dendra2 tillsätt 486 till 553 nanometer, och för röda Dendra2 lägga 580 till 740 nanometer.

Justera kraften och förstärkningen av båda kanalerna efter fluoroforeens intensitet och ställ in tapphålet så att det öppnas helt. Välj ett sekventiellt kanalläge och ställ in spåret så att varje bildruta växlar. Ange skanningsläget som ram och ramstorleken som 1024 med 1024 med ett linjesteg på ett.

Ställ in medelvärdet till två och till genomsnitt med medelvärdet metod och läge för enkelriktad linje. Ställ in bitdjupet på åtta bitar. Definiera inställningen för flerdimensionellt förvärv för konverteringen av Dendra2.

För konvertering och blekning, använd 405 nanometerdiodlaser inställd på 60%energieffekt. Välj en tidsserie med två cykler med ett 0,0 millisekundersintervall mellan cyklerna och en normal start och stopp. Ställ in blekningen till att starta efter scan en av två, att upprepa för 30 iterationer och att stoppa när intensiteten sjunker till 50%Sedan definiera hastigheten på förvärvet pixel bo för att snabbt för konvertering och till medium för att fånga en snap bild.

För att montera nematoder på bilderna, använd en permanent markör för att rita och nummer ett fönster med fyra rutor på motsatsen till agarospaden på varje bild. Tillsätt 15 mikroliter levamisole till mitten av agarospaden och använd ett stereomikroskop och en trådplockning för att överföra för åldersmatchade nematoder i droppen. Använd en ögonfransplockning för att försiktigt flytta varje nematod in i ett fönster på torget.

När alla nematoder har flyttats, vänta tills maskarna har slutat röra sig innan du placerar ett lock glida över vätskan för att immobilisera nematoder under bildbehandling. Placera sedan bilden på konfokalmikroskopet scenen. För grön Dendra2 konvertering, använd okularet av 20 X objektivet under grön fluorescens för att lokalisera den första nematoden och fokusera på huvudet eller svansen.

Växla till konfokalläge och öka eller minska förstärkningen och lasereffekten för att få en mättad, men inte överexponerad bild. Rita en region av intresse runt den valda neuron och dra en andra större region av intresse runt svansen som inkluderar den första regionen av intresse. Ställ in den första regionen som ska förvärvas, blekas och analyseras.

Ställ in den andra intresseregionen som ska förvärvas och analyseras, men inte blekas. Ställ in hastigheten för skanning till maximal och starta skanningen för att konvertera de valda Dendra2 nervceller. Omedelbart efter konvertering, börja levande skanning med den gröna 561 nanometerlaser för att visualisera Dendra2 i den röda kanalen och hitta fokus och respektive maximal projektion av den konverterade neuron.

Snabbt ställa in skanningshastigheten till en lägre pixel bo hastighet och skaffa en ögonblicksbild bild av båda kanalerna med en högre upplösning. Denna bild anses vid tid noll efter konvertering. Spara sedan skanningen med ett identifierbart namn och eller nummer, följt av etiketten tid noll.

För att spåra Dendra2 nedbrytning över tiden, öppna gånger noll bild av respektive nematod neuron. Använda samma bildinställning, börja skanna live i den röda kanalen och föra den konverterade röda neuron i fokus. Sedan, utan att ändra några förvärvsparametrar, få en ögonblicksbild med samma hastighet som den första bilden.

Se till att definiera din konverteringsinställning noggrant för att konvertera Dendra2 effektivt och tillräckligt och för att upprätthålla samma förvärvsparametrar under olika tidpunkter. Om du vill analysera de konverterade Dendra2-bilderna öppnar du bilderna för tid noll och andra tidspunkt i Fiji och öppnar Analysera och Ange mått. Välj funktionerna Område och Integrerad densitet och välj den bild som erhålls med den röda kanalen.

Använda Polygon Selection Tool, rita en region av intresse runt tiden noll konverterade neuron. Om du vill identifiera konturerna av neuronen på rätt sätt väljer du Bild, Justera och Tröskelvärde för att markera intensitetströsklarna. När markeringen har definierats klickar du på Analysera och mät.

Ett pop up-resultatfönster kommer att visas, inklusive området, integrerad densitet och rå integrerad densitet värden för den valda regionen av intresse. Utför samma process för val och mätning för bilden från den andra tidspunkten. Kopiera sedan in värdena i kalkylbladet.

I denna representativa analys före konverteringen var ingen röd signal synlig när provet var upprymd i den röda kanalen. Vid bestrålning, den gröna signalen minskat som HTT-D2 konverterades och en röd signal därefter dök upp. HTT-D2 uttryck försämras med tiden, vilket resulterar i en minskning av nivåerna av röda HTT-D2 signal och en möjlig ökning av den gröna HTT-D2 signalen som mer fusion protein var nyligen syntetiserade.

Noterbart är att nervcellerna i svansregionen var fast beslutna att vara betydligt mer aktiva jämfört med huvudet. Vidare fanns det betydligt mer nedbrytning av kontroll HTTQ25-D2 24 timmar efter konvertering, sedan efter två timmar i både huvud och svans nervceller. Denna skillnad observerades inte i patogena HTTQ97-D2, dock, vilket tyder på att proteostasis nätverket inte kunde ta bort HTT-D2 som innehåller längre glutamin sträcker sig över hela nervsystemet.

HTTQ97-D2 var inte försämras så effektivt som HTTQ25-D2 i mycket gamla nematoder, belyser oförmåga proteostas nätverk för att ta bort aggregerade och eventuellt giftiga arter av Huntingtin i äldre djur. Viktigt, svans nervceller kunde klara av giftiga HTTQ97-D2 i unga nematoder, vilket tyder på att olika samtidiga proteostas nätverksmekanismer kan vara på jobbet för att ta bort HTT-D2. För varje prov förvärva och icke-överexponerad och icke-mättad bild omedelbart efter konvertering och återanvända samma inställning för det provet under hela tiden.

Med detta protokoll är det möjligt att testa förändringar i ett proteostatisnätverk, och även, med hjälp av superupplösningsmikroskopi, för att spåra spridningen av sjukdomstillhörande proteiner.