Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
تحسين Fecundity والخصوبة المقايسة لAedes aegypti باستخدام 24 لوحات زراعة أنسجة البئر (لوحات EAgaL)
Chapters
Summary May 4th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
الموصوفة هي طريقة لتوفير الوقت والمكان لحساب البيض وتحديد معدلات فقس البعوض الفردية باستخدام 24 لوحات زراعة أنسجة الآبار، والتي يمكن أن تزيد بشكل كبير من حجم وسرعة البراز والخصوبة المقايسات.
Transcript
يسمح هذا الإجراء للباحثين البعوض لمعالجة بسهولة اللياقة البدنية البعوض الإنجابية على المستوى الفردي. بالمقارنة مع الطرق التقليدية ، يقلل هذا البروتوكول بشكل كبير من الوقت والمكان والعمل اللازم لاختبار براز البعوض وخصوبتها على المستوى الفردي. ابدأ بإعداد لوحات لتجربة oviposition.
حفر أربعة إلى ستة ثقوب لكل بئر في غطاء لوحة ثقافة 24 بئرا باستخدام الحفر المنزلية مع بت 1.6 ملليمتر. قبل يوم واحد من التجربة، اغسل وشطف الأطباق وانقعها في 1٪ إلى 5٪ تبييض لمدة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، شطف لوحات جيدا تحت تشغيل المياه deionized وتجفيفها.
تذوب 2٪ agarose في الماء deionized وإضافة فورا 500 ميكرولتر من الآغاروز المنصهر إلى كل بئر من لوحة 24 بئرا. اترك اللوحات على مقعد المختبر بين عشية وضحاها لتجفيف أي تكثيف. قبل 16 ساعة على الأقل من تغذية الدم، قم بإزالة أي مصدر للمياه أو السكر من البعوض الأنثوي.
في يوم التغذية ، سخني الدورة الدموية المائية إلى 37 درجة مئوية وأطعم البعوض بالدم الفقاري الموضوع في مغذيات اصطناعية لمدة 15 إلى 30 دقيقة. ثم، نقل البعوض إلى طبق زجاجي على الجليد. حدد تلك التي هي محفورة بالدم ووضعها في وعاء مع الماء السكروز 30٪.
السماح على الأقل 72 ساعة للإناث لإنهاء إفراز وتطوير البيض. قبل حوالي ساعة واحدة من نقل البعوض إلى صفيحة 24 بئرا ، استخدم ماصة نقل لإضافة قطرتين إلى ثلاث قطرات من الماء في كل بئر. هدم البعوض بثاني أكسيد الكربون ونقلها إلى طبق زجاجي على الجليد.
ثم، ضع كل بعوضة بشكل فردي على غطاء مقلوب من لوحة 24 بئرا. بمجرد وضع جميع البعوض ال 24 ، قم بتغطية الغطاء بقاع لوحة مقلوبة ، وتأمينه بشريط مطاطي جديد جديد ووضعه في غرفة بيئية حتى يتعافى البعوض. ثم، بدوره لوحة الجانب الأيمن.
السماح للبعوض الإناث لoviposit لمدة 24 إلى 48 ساعة. ثم، وإزالة الإناث عن طريق الإفراج عنهم من لوحات في قفص كبير. قبل عد البيض، تحقق من كل بئر للبيض على جدران البئر وعلى هامش الآغاروز والسطح البلاستيكي حيث يصعب حلها في الصور الفوتوغرافية.
استخدام فرشاة الطلاء الرطب لنقل هذه البيض إلى سطح مستو بحيث يكون كل البيض في طائرة موحدة ولا تتداخل مع بعضها البعض. استخدم ملقط لإزالة أي كسر في الساقين والأجنحة والجسيمات الأخرى في الآبار التي قد تتداخل مع بيض التصوير. تعيين كاميرا رقمية مدمجة في وضع المجهر، والذي يسمح للمستخدم للتركيز على الكائنات أقرب سنتيمتر واحد واتخاذ صورة لكل بئر.
بعد تصوير كل بئر من لوحة، التقط صورة للوح بأكمله. استخدم ملصق أمر التصوير لتمييز كل لوحة لاحقا. أضف حوالي خمس قطرات من الماء إلى كل بئر لمنع قابس الآغاروز والبيض من التجفيف والحث على نمو الجنين والفقس.
نقل الصور إلى جهاز كمبيوتر وإعادة تسمية الملفات مع لوحة و معرفات جيدا لتسهيل التنظيم. افتح الصور باستخدام ImageJ واستخدم أداة النقاط المتعددة لوضع علامة على كل بيضة، والتكبير أو التصغير لحساب كتل البيض. بعد وضع علامة على كل البيض، انقر نقرا مزدوجا فوق رمز النقاط المتعددة لإحضار عدد العلامات وتسجيل النتائج في جدول بيانات.
ابدأ بإضافة الطعام إلى الآبار التي تحتوي على يرقات مفقسة بمجرد ظهورها. بعد ما يقرب من خمسة إلى ثمانية أيام ، تخدير اليرقات عن طريق تغطية الطبق بالجليد المسحوق لمدة 15 إلى 20 دقيقة. أدخل مادة سوداء تحت اللوحة لتعزيز التباين وأخذ صور لكل بئر مع الحفاظ على الصفائح على الجليد.
بعد تصوير كل بئر، التقط صورة للوحة كاملة مع ملصق أمر التصوير. افتح الصور باستخدام ImageJ واستخدم أداة النقاط المتعددة لحساب اليرقات. يمكن أن تختلف اليرقات في الشكل والزاوية والتركيز.
استبعاد البشرة سقيفة، والتي تبدو وكأنها يرقات الرأس فقط مع القليل من الجسم، أو تقلصت اليرقات. تسجيل النتائج في جدول البيانات. تم حقن البعوض مع الحمض النووي الريبي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل تستهدف الناقل الحديد مرشح، FeT، أو جين التحكم، EGFP.
ثم، كانت تتغذى على الدم وقياسها لالخراز والخصوبة الناتج باستخدام طريقة لوحة النسر. وأظهر البعوض الذي تم إسكات تعبير ناقل الحديد فيه انخفاضا كبيرا في كل من عدد البيض ومعدل الفقس. كما أظهر البعوض الصامت FeT تأخر إفراز والبيض الصغيرة والخفيفة اللون.
التقاط صور جيدة هو خطوة حاسمة لهذه الطريقة لأن نوعية الصور وكمية البيض الفردية أو اليرقات تؤثر بشكل مباشر على نوعية النتائج.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
