Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Verbeterde vruchtbaarheid en vruchtbaarheidstest voor Aedes aegypti met behulp van 24 well tissue kweekplaten (EAgaL-platen)
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Beschreven is een tijd- en ruimtebesparende methode om eieren te tellen en de broedsnelheden van individuele muggen te bepalen met behulp van 24 putweefselkweekplaten, die de schaal en snelheid van vruchtbaarheids- en vruchtbaarheidstesten aanzienlijk kunnen verhogen.
Transcript
Deze procedure stelt muggenonderzoekers in staat om de reproductieve fitheid van hun muggen gemakkelijk op individueel niveau aan te pakken. In vergelijking met conventionele methoden vermindert dit protocol aanzienlijk de tijd, ruimte en arbeid die nodig zijn om de vruchtbaarheid en vruchtbaarheid van muggen op individueel niveau te testen. Begin met het voorbereiden van platen voor het ovipositie-experiment.
Boor vier tot zes gaten per put in het deksel van een 24-put kweekplaat met behulp van een huishoudelijke boor met een bit van 1,6 millimeter. Was en spoel de borden een dag voor het experiment en week ze 30 tot 60 minuten in 1%tot 5%-bleekmiddel bij kamertemperatuur. Spoel vervolgens de platen grondig af onder stromend gedeioneerd water en droog ze.
Smelt 2% agarose in gedeioneerd water en voeg onmiddellijk 500 microliters van de gesmolten agarose toe aan elke put van een 24-put plaat. Laat de platen 's nachts op de labbank liggen om condensatie uit te drogen. Verwijder ten minste 16 uur voor de bloedtoevoer elke bron van water of suiker van de vrouwelijke muggen.
Verwarm op de dag van de voeding een watercirculatiepomp tot 37 graden Celsius en voed de muggen gedurende 15 tot 30 minuten met gewerveld bloed dat in kunstmatige feeders is geplaatst. Breng vervolgens de muggen over in een glazen schaal op ijs. Selecteer degenen die zijn omgorgd met bloed en plaats ze in een container met 30% sacharosewater.
Laat de vrouwtjes ten minste 72 uur de uitscheiding en ei-ontwikkeling afmaken. Ongeveer een uur voordat u muggen naar de 24-putplaat brengt, gebruikt u een transferpipet om twee tot drie druppels water in elke put toe te voegen. Sla muggen neer met kooldioxide en breng ze over in een glazen schaal op ijs.
Plaats vervolgens elke mug afzonderlijk op een omgekeerd deksel van de 24-put plaat. Zodra alle 24 muggen zijn geplaatst, bedek je het deksel met een omgekeerde plaatbodem, zet je het vast met een frisse nieuwe rubberen band en plaats je het in een milieukamer totdat muggen herstellen. Draai vervolgens de plaat naar rechts naar boven.
Laat de vrouwelijke muggen 24 tot 48 uur legponeren. Verwijder vervolgens de vrouwtjes door ze in een grote kooi van de platen los te laten. Voordat u de eieren telt, controleert u elke put op eieren die zich op de putwanden bevinden en aan de rand van het agarose- en plasticoppervlak waar ze moeilijk op te lossen zijn in foto's.
Gebruik een natte kwast om deze eieren naar het vlakke oppervlak te verplaatsen, zodat alle eieren zich in een uniform vlak bevinden en elkaar niet overlappen. Gebruik een tang om gebroken benen, vleugels en andere deeltjes in de putten te verwijderen die de beeldvorming van eieren kunnen verstoren. Stel een compacte digitale camera in de microscoopmodus in, waarmee de gebruiker zich kan concentreren op objecten van maximaal één centimeter en een afbeelding van elke put kan maken.
Nadat je elke put van een plaat hebt gefotografeerd, maak je een foto van de hele plaat. Gebruik een afbeeldingsvolgordelabel om elke plaat later te onderscheiden. Voeg ongeveer vijf druppels water toe aan elke put om te voorkomen dat de agaroseplug en de eieren drogen en om embryoontwikkeling en uitkomen te induceren.
Breng de afbeeldingen over naar een computer en hernoem de bestanden met de plaat en put-ID's voor een eenvoudigere organisatie. Open de afbeeldingen met ImageJ en gebruik het meerpuntsgereedschap om elk ei te markeren, in of uit te zoomen om de eiklontjes te tellen. Nadat u alle eieren hebt gemarkeerd, dubbelklikt u op het pictogram Met meerdere punten om het aantal markeringen te openen en de resultaten in een spreadsheet vast te leggen.
Begin met het toevoegen van voedsel aan de putten die uitgebroede larven bevatten zodra ze verschijnen. Ongeveer vijf tot acht dagen later verdooft u de larven door de plaat gedurende 15 tot 20 minuten met gemalen ijs te bedekken. Plaats een zwart materiaal onder de plaat om het contrast te verbeteren en foto's van elke put te maken terwijl u de platen op ijs houdt.
Maak na het fotograferen van elke put een foto van de hele plaat met een imaging order label. Open afbeeldingen met ImageJ en gebruik de Multi-point Tool om de larven te tellen. Larven kunnen variëren in vorm, hoek en focus.
Sluit de schuursnoeken uit, die eruit zien als larven met alleen het hoofd met een beetje lichaam, of gekrompen larven. Noteer de resultaten in de spreadsheet. Muggen werden geïnjecteerd met dubbelstrengs RNA gericht op een kandidaat-ijzertransporter, FeT, of een controlegen, EGFP.
Vervolgens werden ze gevoed met bloed en gemeten op vruchtbaarheid en vruchtbaarheidsoutput met behulp van de Eagle-plaatmethode. Muggen waarin de uitdrukking van ijzertransporter tot zwijgen werd gebracht, vertoonden een aanzienlijke vermindering van zowel het aantal eieren als de broedsnelheid. FeT-gedempte muggen vertoonden ook vertraagde uitscheiding en kleine en lichtgekleurde eieren.
Het maken van goede foto's is een cruciale stap voor deze methode omdat de kwaliteit van de foto's en de hoeveelheid individuele eieren of larven direct van invloed zijn op de kwaliteit van de resultaten.
Tags
Biologie Kwestie 171 Aedes aegypti,mug geschiktheid eiaantal luiktarief vruchtbaarheid vruchtbaarheid tijdbesparend ruimtebesparendRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
