Medicine
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वीवो इमेजिंग में देशांतर और मानव अग्नाशय आइलेट ग्राफ्टिंग और पूर्वकाल नेत्र कक्ष में मेजबान कोशिकाओं का योगदान
Chapters
Summary June 11th, 2020
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इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मानव अग्नाशय आइलेट एनग्रेफ्टमेंट प्रक्रिया और योगदान मेजबान बनाम दाता कोशिकाओं की गतिशीलता की लगातार निगरानी करना है। यह एक मंजूरी के आंख (ACE) के पूर्ववर्ती कक्ष में मानव आइलेट्स प्रत्यारोपण द्वारा पूरा किया जाता है । (Cg)-gt (ROSA) 26Sortm4-Rag2-/-माउसप्राप्तकर्ता दोहराया 2-फोटॉन इमेजिंग के बाद ।Rag2-/-
Transcript
ऐस एक इष्टतम इमेजिंग स्थलों है। यह एक ग्राफ्टिंग स्थिति में उनके कार्य और व्यवहार्यता का अध्ययन करने के लिए आइलेट कोशिकाओं के वीवो इमेजिंग में लंबे समय तक इसे दोहराने का समर्थन करता है। इसे वास्तविक समय में शारीरिक और रोग स्थितियों के तहत अन्य पहलुओं का अध्ययन करने के लिए भी बढ़ाया जा सकता है।
ऐस तकनीक का लाभ इस तथ्य में निहित है कि एक ही व्यक्तिगत मानव अग्नाशय के आइलेट्स को विस्तारित अवधि के लिए उप-सेलुलर संकल्प के साथ गैर-निवासात्मक रूप से पालन किया जा सकता है। बीटा सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी की सफलता दर में सुधार जारी है। हालांकि, वीवो में आइलेट ग्राफ्टिंग और अस्तित्व की दक्षता का मूल्यांकन करना अभी भी चुनौतीपूर्ण बना हुआ है।
यह विधि आइलेट प्रत्यारोपण के परिणामों का आकलन और अनुकूलन करने में मदद कर सकती है। यह दृष्टिकोण केवल अग्नाशय के आइलेट्स तक ही सीमित नहीं है। यह प्रभावित ऊतकों का अध्ययन करने के लिए भी अच्छी तरह से अनुकूल है।
उदाहरण के लिए, मधुमेह की जटिलताओं में, गुर्दे की ग्लोमेरुली या जिगर के टुकड़े की तरह, बस कुछ नाम करने के लिए। माउस को गर्म हीटिंग पैड पर रखने के लिए इसे हेड होल्डर में रखें और नाक मास्क पर रखें। सिर को थोड़ा उठाने के लिए अंगूठे और इंडेक्स फिंगर का इस्तेमाल करें।
इसे किनारों पर धातु के टुकड़ों के साथ जकड़ना। यह सुनिश्चित करना कि कान के टुकड़े कान के सीधे नीचे सिर को ठीक करते हैं। चमड़े के नीचे माउस के पीछे बुप्रेनोरफिन समाधान इंजेक्ट करें।
मुंहफट संदंश का उपयोग करके प्रत्यारोपित की जाने वाली आंखों की पलकों को धीरे-धीरे वापस लें। आंख को बाहर पॉप करें और इसे पॉलीथिन ट्यूब से ढके चिमटी की एक जोड़ी के साथ शिथिल रूप से ठीक करें। पीबीएस के साथ एक पेट्री डिश में पलकों को स्थानांतरित करने के बाद, आंख के कैन्यूलर में लगभग 20 से 30 आइलेट्स उठाएं।
ऊपर की ओर 25 गेज सुई के स्तर का उपयोग करके, सावधानी से टिप को कॉर्निया में डालें और एक पार्श्व चीरा बनाएं। सावधानी से आइलेट्स के साथ पूर्व भारित कैनुला के साथ कॉर्निया उठाएं, और धीरे-धीरे आइलेट्स को आंखों में छोड़ें। धीरे-धीरे कैनुला को वापस लें और आंखों पर आई जेल लगाएं।
10 मिनट के बाद, संदंश को हटा दें, पलक को पकड़ें और आंख को वापस अपनी सामान्य स्थिति में डाल दें। दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ प्रत्यारोपित मानव आइलेट्स की इमेजिंग के लिए, सिर धारक मंच को माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और कॉर्निया और लेंस के बीच विसर्जन तरल के रूप में आंखों पर आंख जेल का प्रशासन करें। उद्देश्य के तहत आंख की स्थिति और छवि प्रत्यारोपित मानव आइलेट्स के रूप में पाठ पांडुलिपि में वर्णित है ।
ऑटोफ्लोरेसेंस को हटाने के लिए, इमेज प्रोसेसिंग टैब पर जाएं, चैनल अंकगणित चुनें और चैनल एक माइनस चैनल दो टाइप करें। यह एक नया चैनल चार बनाता है। इसका नाम बदलें।
इस प्रक्रिया को दोहराएं और एक नया चैनल पांच बनाने के लिए चैनल तीन माइनस चैनल दो टाइप करें और इसे सभी टमाटर का नाम बदलें। आइलेट को मैन्युअल रूप से एक नई सतह बनाने और जादूगर में मैन्युअल रूप से संपादित करने के लिए परिभाषित करने के लिए। पॉइंटर को चुनिंदा मोड में और 3D व्यू में रखें।
और अनुभागों की कल्पना करने के लिए वॉल्यूम पर क्लिक करें। ड्राइंग टैब में कंटूर चुनें और आइलेट सीमा के चारों ओर आकृति ड्राइंग शुरू करने के लिए ड्रा पर क्लिक करें, स्लाइस स्थिति एक में शुरू। फिर एक नई स्लाइस स्थिति में जाएं और ड्राइंग आकृति दोहराएं।
आइलेट के शीर्ष पर अंतिम टुकड़ा के साथ समाप्त करें और बनाएं सतह टैब पर क्लिक करके समाप्त करें। अगला खंड, आइलेट वैक्यूलेचर और आइलेट टमाटर फ्लोरेसेंस आइलेट मास्क का उपयोग करके। पहले से परिभाषित आइलेट मास्क ऑब्जेक्ट चुनें, एडिटिंग टैब पर जाएं और मास्क ऑल टैब पर क्लिक करें, जो एक नई विंडो खोलता है।
चैनल सेलेक्शन ड्रॉपडाउन मेन्यू में वैक्यूलेचर चैनल चुनें और मास्क लगाने से पहले ऑप्शन डुप्लीकेट चैनल एक्टिवेट करें। लगातार अंदर, बाहर और 0.000 जो एक नया चैनल छह बनाता है करने के लिए सतह के बाहर स्वर सेट। इस चैनल आइलेट वैक्यूलेचर का नाम बदलें।
पिछले चरणों को दोहराएं और नए चैनल बनाने के लिए, इसका नाम बदलें, आइलेट टमाटर, चैनल चयन ड्रॉपडाउन मेनू में टमाटर सभी चुनें। फिर दृश्य मेनू में एक नई सतह बनाएं और जादूगर में स्वचालित निर्माण चुनें। स्रोत चैनल को पहले से बनाए गए आइलेट वेक्यूलेचर में सेट करें और पृष्ठभूमि घटाव चुनें।
वैकल्पिक रूप से फिल्टर का उपयोग करें। उदाहरण के लिए वॉल्यूम चुनें और फ़िल्टर को विंडो में समायोजित करें, जो चयनित सेवा वस्तुओं को हटा सकता है। जादूगर को समाप्त करें और नई सतह वस्तु, आइलेट वेक्यूलेचर का नाम दें।
आइलेट वैक्यूलेचर सर्विस ऑब्जेक्ट में एडिटिंग टैब पर जाकर मास्क ऑल टैब पर क्लिक करें, जो एक नई विंडो खोलता है। चैनल चयन ड्रॉपडाउन मेनू में आइलेट टमाटर चैनल चुनें और सतह के बाहर स्वर सेट 10.000 जो एक नया चैनल बनाता है। इस चैनल का नाम बदलें आइलेट टमाटर वक्यूलेचर।
टमाटर कैप्सूल फ्लोरोसेंट सिग्नल को सेगमेंट करने के लिए इमेज प्रोसेसिंग टैब में चैनल अंकगणित का चयन करें और नए चैनल का निर्माण करने वाले चैनल सात माइनस चैनल आठ टाइप करें। इसका नाम बदलकर टमाटर कैप्सूल करें। पहले वर्णित एक नई सतह बनाएं और जादूगर में स्रोत चैनल, आइलेट टमाटर वाक्यूलेचर या टमाटर कैप्सूल चुनें।
फिर पृष्ठभूमि घटाव करते हैं। आइलेट बैकस्कैटर फाइल खोलें और एक नई सतह बनाएं। जादूगर में, स्वचालित निर्माण चुनें और रुचि के क्षेत्र को परिभाषित करें।
यदि आवश्यक हो, तो सीमा को पूर्ण तीव्रता में समायोजित करें। सतह वस्तु पर या बंद क्लिक किया जा सकता है, इसी चैनल तीव्रता के साथ क्रॉसचेक करने के लिए । जब जादूगर बंद समाप्त हो गया।
अंत में, मात्राकरण करें, दृश्य मेनू में एक निर्मित सतह वस्तु का चयन करें, और सांख्यिकी टैब पर जाएं। विस्तृत वॉल्यूम डेटा को पुनः प्राप्त करने के लिए, विस्तृत टैब चुनें और ड्रॉपडाउन मेनू से विशिष्ट मूल्यों और मात्रा का चयन करें। कुल वॉल्यूम मूल्य को पुनः प्राप्त करने के लिए विस्तृत टैब पर जाएं और औसत मूल्य चुनें।
इस प्रोटोकॉल के लिए आठ सप्ताह पुरानी महिला लाल फ्लोरोसेंट प्राप्तकर्ता चूहों की आंख के आंतरिक कक्ष में गैर लेबल मानव आइलेट्स प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया गया था । इसके बाद इंटरएक्टिव इमेजिंग सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल छवियों से मात्रात्मक डेटा निकालने के लिए किया गया । वीवो फ्लोरोसेंस इमेजिंग में, मानव आइलेट ग्राफ्ट को ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस से महत्वपूर्ण हस्तक्षेप से समझौता किया गया था जिसे चूहों आइलेट ग्राफ्ट में नहीं देखा गया था।
शोर अनुपात के लिए संकेत में सुधार करने के लिए, ऑटोफ्लोरेसेंस चैनल घटाया गया था । फिर आइलेट सीमा को आइलेट मास्क कहा जाता है और संबंधित चैनलों को मैन्युअल रूप से परिभाषित किया गया था। अंत में, टमाटर के संकेत को पलक वास्कुलेचर और पलक कैप्सूल और अंतिम सतह प्रतिपादन में विभाजित करने का उपयोग मात्रात्मक डेटा निकालने के लिए किया गया था।
यहां दो सप्ताह, दो महीने, पांच महीने और आठ महीने के बाद प्रत्यारोपण में एक ही मानव आइलेट भ्रष्टाचार के एक प्रतिनिधि देशांतर इमेजिंग सत्र के रूप में । मूल रूप से दर्ज कच्चे डेटा की एमआईपी छवियां, आइलेट ऑटोफ्लोरेसेंस हटाने के बाद संसाधित छवियां और एक खंडित आइलेट ऑब्जेक्ट्स दिखाए जाते हैं। पलक इंजेक्शन का प्रदर्शन करते समय, आइलेट्स को थोड़ी मात्रा में प्रीलोड करना सुनिश्चित करें और अपने स्टीरियो माइक्रोस्कोप पर लचीले जुड़वां प्रकाश हथियारों का उपयोग करें, ताकि आइईटी में आइलेट्स को सफलतापूर्वक इंजेक्ट करने के लिए आंखों के चैंबर स्पेस को हाइलाइट किया जा सके।
वीवो इमेजिंग में आंखों के बाद तय किया जा सकता है और आगे एंटीबॉडी धुंधला और पारंपरिक हिस्टोलॉजी के लिए जांच की । यह तकनीक वास्तविक समय में और शारीरिक परिस्थितियों में व्यक्तिगत मानव आइलेट्स के कार्यात्मक अध्ययनों के लिए बहुत उपयोगी है, विशेष रूप से संवहनी, व्यवहार्यता और मेटाबोलिक अध्ययन के संदर्भ में।
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