Developmental Biology
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創傷による多重化を研究する ショウジョウバエ モデル
Chapters
Summary June 9th, 2020
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創傷誘発倍化は、細胞の損失を補うために分割する代わりに細胞のサイズが成長する保存された組織修復戦略です。ここでは、上皮創傷修復における策略とその遺伝的調節を測定するモデルとしてフルーツフライを使用する方法に関する詳細なプロトコルがあります。
Transcript
このプロトコルは、創傷誘発倍化を研究するために使用することができる。細胞が成体のフルーツフライで分裂する代わりに成長する組織修復プロセスを保存する。単純な穿刺傷は、わずか2日以内にハエ上皮の多倍率を誘発するために作ることができる。
上皮細胞のサイズ、策略および組織は、その後容易に評価することができる。興味のある株の10〜15新しく閉じた女性のフルーツハエを含む2つのバイアルを収集することから始めます。そして、生鮮食品バイアルでハエを老化させ、生後3〜5日まで摂氏25度でバイアルあたり約5匹のオスのハエを飼育しています。
腹部の傷のために、インキュベーションの終わりに、単一の0.1ミリメートルのステンレス鋼のピンを使用して、各ピンの鋭い端がペースアウトして、いくつかのピンホルダーを組み立てます。老朽化した雌のフルーツフライをステレオ顕微鏡で二酸化炭素フライパッドで麻酔します。そして、行にハエを配置するためにペイントブラシを使用しています。
安全メガネを着用し、片手にピンホルダーを持ち、もう一方の手に鉗子を使用して、腹側腹部を上に向けてハエを配置します。その後、成人雌ハエは、腹側中中線の両側の標的A4の上皮青色右領域内で穿刺し、負傷したハエを目的の実験時間後の傷害まで食物バイアルに戻す。実験エンドポイントでは、ステレオ顕微鏡の下で麻酔フライごとに創傷と傷跡の存在を確認し、グレースの溶液で9つの井戸ガラス解剖皿の1つの井戸を満たします。
鉗子のペアを使用して、胸郭の後ろ側で負傷した女性のハエをつかみ、溶液の井戸にハエを沈めます。一方、2番目の鉗子を使用して、フルーツフライの後部にあるターゲットA6の下の後部キューティクルを穿刺して取り除きます。内臓が抽出されない場合は、腹部の背側に圧力をかけ、残りの器官を絞り出す。
鉗子を使用して、ターゲットA2の上の胸郭接合部の完全な腹部を取り除き、約100マイクロリットルのグレース溶液を含むウェルに腹部を移します。すべての腹部が収集されたら、コレクション内のグレースの溶液の量を30マイクロリットルに減らします。一方の手で鉗子を使用して腹部の後側を下に保持し、もう一方の手を使用してヴェネツィアのスプリングハサミの底刃を各腹部の腹腔に挿入し、腹部が完全に開くまで後回し中線に沿って切断します。
腹部取り付け領域あたり4.1ミリメートルのピンを備えた乾燥解剖板の各取り付け領域にグレースの溶液の30マイクロリットルを追加し、フィレ化された腹部を溶液の液滴に入れます。すべての腹部がフィレ化され、配置されたら、4つの後ろ隅の皿に腹部を固定します。組織が引き裂いたり、腹部の組織を伸ばしたりすることなく平らに横たわっていることに注意してください。
次に、Graceの溶液を30マイクロリットルの固定液を取り付け面積あたりに交換します。各皿の底にテープラベルを貼って、各コントロールと実験グループをマークします。フライ組織サンプルを取り付ける。
染色後、解剖板から腹部を立体視顕微鏡で固定解除するために鉗子を使用します。また、鉗子を使用して、個々のガラスカバースリップ上の約30マイクロリットルの取り付け媒体に、その後側の側面によって各サンプルを移す。ステレオ顕微鏡の下では、内側がカバースリップに向かって下向きになるように腹部組織を向け、鉗子を使用して配向腹部を各メディアの液滴の端まで引っ張ります。
取り付けられた各カバースリップをラベル付きのガラススライドに置きます。そして、ラボ組織を使用して、余分な取り付け媒体を除去します。その後、透明なマニキュアでカバースリップの端を密封し、そのイメージングまで4°Cでスライドボックスにスライドを保存します。
セプセート接合タンパク質は、細胞細胞接合を標識する3つの速い、調製中に何らかの処理摂動が起こったかどうかを示す指標を提供する。傷領域を摂動する未染色領域の大きな傷を有する腹部は、廃棄され、分析に含まれてはならない。創傷修復は、中央の大きな多核細胞が創傷のかさぶたを覆うときに完了する。
上皮シート上の10マイクロメートルを超えるギャップは、創傷閉鎖および再上皮化における欠陥と考えられる。この代表的な分析では、有糸分裂細胞活性化を阻害したハエを用いて、創傷の52%が創傷のかさぶたの上に連続的な上皮シートを形成することができなかった。この膜創傷治癒エッセイは、創傷修復欠陥の程度により多くの情報を提供し、再表皮化欠陥を完全に開いた、部分的に閉じた、または完全に閉じたものとしてグループ化することができる。
例えば、本実験では、エンド複製と細胞融合の同時遮断による創傷誘発多重化の阻害は、上皮創傷の92%で完全に開いたままにする。有糸分裂細胞周期の活性化は上皮創傷閉鎖欠陥をもたらした。また、チミジンアナログEDUの組み込みにより細胞周期活性を検出し、上皮策略は核DNA含有量を直接測定することによって決定した。
腹部上皮を解剖する際には、サンプルを傷つけるため、ディセッティングツールで組織に触れないように注意してください。解剖後、細胞増殖、細胞死、細胞損失切開サイズまたは核DNA含有量評価を行い、創傷誘発倍化をより良く理解することができる。または上皮内の他のプロセス。
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