Ikke-radioaktiv analyse for å måle polynukleotidfosforylering av små nukleotids underlag

Denne metoden kan svare på viktige spørsmål om fosforyleringen av den fem-prime enden av DNA- eller RNA-molekylene ved en spesiell klasse enzymer kjent som polynukleotidkinase. Den største fordelen med denne teknikken er at den har oppløsningen til å oppdage svært små endringer i DNA- og RNA-substrater. Begynn med å forberede RNA-enzymet kinase reaksjoner.

For hver reaksjon, kombinere en mikroliter på 500 nanomolar RNA substrat. 8,3 mikroliter på 130 nanomolar siste, GRC tre og 0,2 mikroliter på fem millimolar EDTA. Sett varmeblokken til 37 grader Celsius.

Bland deretter 0,5 mikroliter av en ATP-underlager fra konsentrasjonsserien med en RNA-enzymblanding og plasser reaksjonen på varmeblokken. Fortsett å blande reaksjonene og legg dem på varmeblokken med ti sekunders intervaller. Etter en 60 minutters inkubasjon på varmeblokken, slukke hver reaksjon ved å spiking den med 10 mikroliter urea lasting fargestoff.

Utfør umiddelbart nedstrømsanalyse eller lagre reaksjonene ved negative 20 grader Celsius som skal analyseres på et senere tidspunkt. For å forberede en 15% denaturing akrylamid gel løsning, kombinere 22,5 milliliter pre-blandet 40%29 til en akrylamid / bis akrylamid løsning. Seks milliliter på ti x TBE.

28,8 gram urea. Og RNase fritt vann til et totalt volum på 59 milliliter. Rør deretter forsiktig løsningen.

Varm opp løsningen i mikrobølgeovnen i 20 sekunder. Rør den og returner den umiddelbart til mikrobølgeovnen i ytterligere 20 sekunder. Rør forsiktig løsningen til urea er fullstendig oppløst.

Legg glassbegeret i et grunt vannbad, som inneholder kaldt vann i fem minutter, og pass på at nivået av kaldt vann rundt glassbegeret er over oppløsningsnivået inne i glassbegeret. Når løsningen er avkjølt, må du filtrere og avgasse den med en engangsfiltreringsenhet på 0,2 mikrometer for å fjerne partikler og mikroskopiske luftbobler. Vask en kort og lang glassplate med såpe og vann og spray deretter hver plate med 95% etanol og tørk av glasset for å fjerne fuktighet.

Løft den lange platen av benkeplaten ved å plassere den på toppen av en boks. Plasser deretter 0,4 millimeter avstandsslang langs langsidene på platen. Legg den korte platen på toppen av den lange platen, og pass på at kantene på den korte platen, langplaten og avstandsslene er justert.

Klem deretter på hver side med tre jevnt fordelte metallklemmer. Tilsett 24 mikroliter TEMED til akrylamidoppløsningen og bland den. Tilsett deretter 600 mikroliter på 10% APS og hell umiddelbart løsningen mellom glassplatene.

Det kan være veldig utfordrende å helle akrylamidløsningen mellom glassplatens sandwich. For å unngå luftbobler, trykk på glassplatesmørbrødet mens du heller løsningen. Tilsett forsiktig en ren 32-brønns kam til toppen av glassplatens sandwich.

Og la akrylamidet polymerisere i 30 minutter. For å kjøre gelen, sett varmeblokken til 75 grader Celsius. Fjern metallklemmene.

Og vask og tørk glassplatens sandwich grundig. Plasser platesmørbrødet og gelapparatet med den korte platen vendt fremover og klargjør 0,5 X TBE løpebuffer ved å kombinere 100 milliliter 10 X TBE med 1,9 liter RNase fritt vann. Tilsett 600 milliliter av løpebufferen til de øvre og nedre kamrene i apparatet.

Fjern forsiktig kammen fra gelen og skyll brønnene grundig med en sprøyte. Forhåndsdrevne gelen på 50 Watt i 30 minutter. Skyll deretter brønnene igjen.

Post spinne slukke reaksjoner og inkubere dem på 75 grader Celsius i tre minutter. Gjenta pulsspinnen og legg umiddelbart 10 mikroliter av hver prøve på gelen. Kjør deretter gelen i tre timer ved 50 Watt.

Når løpet er ferdig, slå av strømforsyningen og tøm det øvre kammeret av apparatet. Vask og tørk den ytre siden av glassplaten sandwich. Dekk den deretter med folie og overfør den til en laserskanner for avbildning.

Monter glassplatens sandwich på scenen på laserskanneren. Sett eksitasjon og utslipp bølgelengder for ønsket gulv for og bilde gelen. Vist her er en representativ vellykket denaturing gel av en titrering av ATP med en fast mengde siste EN GRC tre kompleks.

Tilsetning av enzym resulterte i siste mediert RNA-spaltning av Saccharomyces cerevisiae ITS to RNA-substrat, noe som førte til et definert RNA-fragment. Ved tilsetning av ATP ble C2 RNA-fragmentet fosforylert av GrC3 PNK. For å visualisere fosforyleringen av C2 RNA-fragmentet ble den relative mengden ukosforylert og fosforylert C2 RNA plottet mot ATP-konsentrasjonen.

Vår representative mislykkede denaturing gel er vist her. 21 nukleotid RNA-substratet inneholdt nedbrytningsprodukter, som overlappet med fosforylert produkt og gjorde det umulig å nøyaktig kvantifisere fosforylering. I motsetning kan det korteste RNA-nedbrytningsproduktet analyseres med hell fordi dette området av gelen ikke inneholdt noen ekstra RNA-arter som hindret nøyaktig kvantifisering av sin fosforylert motstykke.

Det viktigste å huske når du prøver denne protokollen er å skylle brønnene på gelen for å sikre jevn lasting av prøven. Etter denne prosedyren kan et RNA-omsetningseksperiment utføres. For å måle frekvensen av RNA-nedbrytning signaliserer fosforylering ofte initiering av RNA-nedbrytning.

Denne teknikken baner vei for å svare på detaljerte spørsmål om aktivitetene spesifisitet og kinetikk av polynukleotid kinaser.