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使用转基因钙处理器 Aequorin 前向基因屏幕，以识别钙信号中的新目标
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Summary August 1st, 2020
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基于Ca2+高程的向前遗传屏幕作为读出，可以识别植物中钙依赖信号通路所涉及的遗传成分。
Transcript
该协议的目的是确定一种方法，可用于识别与钙信号相关的新基因。为此，我们使用经典的前向基因屏幕。钙信号是几个植物系统中重要的防御响应途径。
为了识别这一途径中涉及的基因，我们使用了经典的前向基因屏幕。在这种方法中，EMS将用作在植物系统中引入随机突变的alkylating剂。然后，发育中的突变生成可用于筛选感兴趣的表型。
一旦确定了感兴趣的表型，就可以绘制因果基因。在这项研究中，我们使用模型植物阿拉伯，其光谱中含有钙处理者aequorin。重150毫克种子的aequorin为EMS突变和另150毫克种子用作控制。
将种子转移到50毫升猎鹰管中，加入2%EMS或自动处理水。使用 EMS 时，要小心，因为它是致癌的。使用 EMS 时应佩戴防护齿轮，并防止任何类型的溢出。
用石蜡密封猎鹰管，并包裹铝箔。在室温下将管端绕端旋转 18 小时。让种子小心地沉淀和去除 EMS 溶液，然后丢弃在含有一个摩尔 NaOH 的废物容器中。
用40毫升的自洗水彻底清洗突变的种子至少8次。对于最后的洗涤，加入100毫摩尔硫化钠，并冲洗至少三次，以去除EMS的痕迹。将种子浸泡在40毫升的自洗水中一小时，将EMS从种子中散开，然后放在 Whatman 纸上，直到完全干燥。
将种子转移到埃彭多夫，在四摄氏度下孵育两到四天进行分层。将喃化种子和水处理的种子转移到土壤上，在22摄氏度和70%相对湿度下，在16小时光和8小时暗照期将它们转移到生长室。为了确定诱变是否成功，寻找叶绿素分区。
我们使用了基于单一的基于血统的种子收集方法，每个 M1 植物都有一个唯一的数字。成熟后，种子从这些单独的突变植物中收获，并储存为单独的M1线。采用兰夫等人改编的高通量种子灭菌和水培植物根协议。
第一天，将每M1种子近12至15 M2种子放在24孔组织培养板的个别井中，使用次氯酸钠和盐酸溶液以3比1的比例进行灭菌。这释放氯气，消毒种子。将板留一夜，将剩余的氯气完全蒸发。
灭菌后，将半强度液体MS介质加入单个水井，在4摄氏度下将种子分层2至4天，然后将种子移动到一个生长室，其照片周期为10小时光，14小时黑暗，湿度为22摄氏度，相对湿度为70%。在第14天，一旦幼苗是8至12天大，将12M2苗分别从每行在96井的发光计板。幼苗转移后，在个别井中加入150微升5微摩尔Coelenterazine溶液，并在21摄氏度的黑暗中储存8小时。
Coelenterazine 是一个假肢组，它与阿波奎林结合，形成功能 aequorin。Coelenterazine 对光敏感，因此储存在深色瓶子中，防止光线。第二天，筛选突变体使用过氧化氢作为刺激，并测量随后的钙升高。
对于24孔的同步测量，可进行出自动动力学程序，包括测量背景1分钟，然后进行刺激加法和测量10分钟，然后放电注入150微升，测量3至5分钟。并且，任何对女儿的放电，将包含在读数中，以量化测量的钙，并作为功能水素的额外控制。上述方法提供的读数为相对光单位。
为了计算细胞酸钙离子浓度，使用了2004年租金和骑士给出的先前描述的浓度方程，在协议中描述了这一点。从发光计中获得的RLUS被添加到方程中，以计算钙离子浓度。然后，根据野生类型控制以图形方式绘制获得的细胞酸钙离子值，以识别对钙反应的对质的过氧化氢突变体。
这是显示的协议的代表性结果。我们展示了一条M1线，其中有12个个体幼苗，它们已被测量为钙离子浓度的升高。图中的绿线表示与突变体一起测量的野生型 aequorin。
红色是所有12株幼苗的平均值，黑线是为钙离子高程测量的单个M2幼苗。然后，对过氧化氢应用反应极小的幼苗被救出。然后，被救出的突变体在下一代中再次确认，然后进行映射以识别因果基因。
使用 EMS 作为突变物时应小心谨慎，因为它是致癌物质。应随时佩戴防护齿轮，任何溢漏都应采用良好的实验室做法。此外，在进行基于血统的种子收集时，应极其小心地收获单个植物，以便在任何阶段不混合任何种子。
这将有助于人们回去追踪母植物，即同源突变植物。此外，由于此方法不引入任何偏见或任何先前的假设到筛选方法，它可用于一个或多个条件，以确定感兴趣的表型。此外，也可以使用相同的协议来识别多个独立基因。
该协议是易于使用，因为与小剂量，大量的植物可以静音。这些大量的突变植物可用于多个种群和几个条件，并识别几个基因。可以通过这种方法识别部分功能丧失、功能改变、功能完全丧失或构成基因功能。
鉴于当前方案中的映射技术的进步，映射应该是一项容易的任务。基于新基础的制图系统、基于SNP的种族绘图和许多其他方法都可以用来识别导致感兴趣的表型的因果基因。鉴于这种方法的适用性，它不仅可用于阿拉伯模型植物，而且可用于其他模型植物，也只要可以建立兴趣读出的表型。
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