A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Culturing Rat Sympatiska nervceller från embryonala Superior Cervical Ganglier för morfologiska och proteomisk analys
Chapters
Summary September 27th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Detta dokument beskriver isolering och odling av embryonala råtta sympatisk nervceller från den överlägsna livmoderhalscancer ganglier. Det ger också detaljerade protokoll för immunocytochemical färgning och för att förbereda neuronal extrakt för masspektrometrisk analys.
Transcript
I den här videon kommer vi att demonstrera odling av embryonala råttor överlägsna livmoderhalscancer ganglier för morfologiska och proteomic analys. Innan du börjar dissekering, förbereda kontroll och dissektion media. Kontroll medium innehåller F-12 och låg glukos DMEM kompletteras med en insulin-selen-transferrin blandning, glutamin, nerv tillväxtfaktor, och BSA.
Dissektionsmedium innehåller L-15 kompletterat med pen-strep och BSA. Se manuskriptet för detaljerade protokoll för medieberedning. Beredning av plattor för culturing nervceller.
Späd ett milligram per milliliter lager av poly-D-lysin till 100 mikrogram per milliliter med sterilt destillerat vatten. För proteomisk eller genomisk analys, en till två dagar före dissektionen, belägga sex-brunnsplattor med cirka två milliliter sterila 100 gram per milliliter poly-D-lysin. Detta är nödvändigt för att säkerställa celladhesion till brunnen.
Linda plattorna med plastfolie och förvara plattorna över natten i fyra grader Celsius. På dagen för dissektionen, innan dissektionen börjar, avlägsna poly-D-lysinlösningen från brunnarna och skölj brunnarna fem gånger med sterilt destillerat vatten, följt av en gång med lågglukos-DMEM. Under den enzymatiska matsmältningen av ganglierna, ungefärligt en timme, för att plätering cellerna, aspirate DMEMEN från pläterar och byter ut den med 0.3 milliliters av kontrollerar medelmedium.
Förvara plattorna i 35 grader Celsius under 5 %CO2 i en befuktad kammare. I huven, ställa in följande objekt för dissektion. Fyra 50 milliliter sterila koniska rör med ca 20 milliliter dissektionsmedia i varje rör.
Fyra sterila 35 millimeters rätter med 1,5 milliliter dissekeringsmedia. Ett sterilt koniskt rör på 50 milliliter med 20 milliliter dissektionsmedia för centrifugeringen. Ett 15 milliliter sterilt koniskt rör för centrifugering av ganglierna, ett sterilt 10 milliliterrör för att samla upp de dissocierade cellerna.
Använd en torr pärlor sterilisator för att sterilisera ett par fina tång i minst en minut. Alla förfaranden som utförs i studier med djur godkändes av institutionella Animal Care and Use Committee vid Saint Mary's College of California. Den djurvård och användning riktlinjer vid Saint Mary's College of California har utvecklats baserat på riktlinjer som tillhandahålls av Office of Laboratory Animal Welfare vid National Institutes for Health.
Avlägsnande av E21 embryon från den dräktiga råttan. Observera att avlägsnandet av livmoderhornet kan utföras utanför huven om omgivningen är noggrant steriliserad. Avliva en dräktig råtta med CO2 inandning.
Skjår pälsen från bukregionen och torka huden i området med 70%alkohol för att sterilisera den. Med hjälp av en ny uppsättning av steril sax och tlyktor, skär genom huden och sedan muskeln för att exponera livmoderhorn som innehåller embryona. Ta bort livmoderhornet med embryona, med hjälp av en ny uppsättning saxar och tlyktor, var noga med att inte skada tarmarna i processen.
Överför livmoderhornet med embryona i 150 millimeters steril petriskål och överför dem i huven. Med hjälp av en ny uppsättning tlysen och saxar, ta bort embryona från livmoderhornet och separera embryona från fosterhinnorna och moderkakan. För att avliva embryona, skär ryggmärgen av embryona längs mittlinjen under höger arm.
Detta kommer att minska blödningen från halspulsådern under avlägsnande av SCG. Överför dessa embryon i de beredda konditorirören på 50 milliliter som innehåller dissektionsmedia. Se till att embryona är nedsänkta i media.
Varje rör kan rymma upp till tre embryon. Isolering av den överlägsna cervikala ganglion från embryot. Överför en valp från dissekeringsmediet på en steril 150 millimeter petriskål halvfylld med fast substrat med sin ryggyta på substratet.
Med hjälp av tre sterila 23 gauge nålar, stift puben till skålen med en nål under varje arm och en tredje nål genom munnen för att noggrant hyperextend halsen. Skär genom huden i nacken regionen med hjälp av sterila fina tärna för att exponera spottkörtlarna under. Ta bort dessa körtlar med hjälp av fina tröpningar.
Lokalisera sternocleidomastoid och omohyoid muskler nära nyckelbenet och luftstrupen respektive. Först, skär tvärgående sternocleidomastoid muskler. Och sedan försiktigt skära den tunna omohyoid muskeln med hjälp av fina tärningar.
När dessa muskler tas bort, kommer bifurkation i halspulsådern på främre änden, vara synlig på vardera sidan av luftstrupen med SCG ligger under denna gaffel i halspulsådern. Med hjälp av slutna tång, lyft försiktigt halspulsådern för att visualisera SCG. Med hjälp av en tärna på vardera sidan av SCG, dra ut halspulsådern och överföra den till den beredda sterila 35 millimeter rätter.
Denna vävnad kommer troligen att innehålla SCG med halspulsådern, vagusnerven med nodose ganglierna, liksom andra segment av muskler eller fett i området. Upprepa dissekeringsprocessen på andra sidan. Ta bort SCGs från alla embryon innan du fortsätter med de återstående dissekering steg beskrivs.
Fördela de isolerade vävnaderna mellan två av de 35 millimeters diskarna för att underlätta bearbetningen av vävnadsproverna. Efterbearbetning av SCG. För att skilja SCG från den dissekerade vävnaden, använd först fina tövråkar för att avlägsna eventuell ovidkommande vävnad, såsom muskel eller fett, var noga med att undvika området nära halspulsådern bifurkation.
När dessa vävnader har tagits bort, två ganglier är synliga. Den nodose ganglion är mindre och cirkulär medan SCG är mandel formad. Dra försiktigt på vagusnerven för att separera vagusnerven och nodose ganglierna från halspulsådern och sedan separera SCG från halspulsådern.
Använd fina tyfningar för att ta bort kapseln som omger SCG. Överför SCG till en ny 35 millimeter kultur skålen. Upprepa denna process med alla dissekerade vävnadsprover.
Belägga en steriliserad, bomullspluggad glaspilett med dissection media för att förhindra att vävnaden från att hålla sig till pipetten väggar. Använd pipetten för att ersätta dissektmediet med sterila två milliliter av kollagenastyp II, dispase typ II i kalcium och magnesiumfri HBSS och inkubera i 50 minuter vid 37 grader Celsius för att hjälpa till att bryta ner vävnaderna. Observera att inkubationstiderna kan behöva optimeras med olika partier av kollagenas/dispase och vanligtvis varierar från 40 minuter till en timme.
Efter inkubationen överför du SCGs och collagenas/dispase till ett sterilt koniskt rör på 15 milliliter. Använd dissektionsmediet för att skölja plattorna och överföra lösningen till röret. Lägg till tillräckligt med dissektionsmedia för att få volymen till cirka 10 milliliter.
Centrifugera vid 200 x g, 1, 000 till 1, 200 rpm i fem minuter vid rumstemperatur för att pelleta provet. Aspirera supernatanten, var noga med att inte rubba pelleten. Resuspend pelleten med 10 milliliter av dissekeringsmedia, upprepa centrifugeringen och kassera supernatanten.
Ersätt med en till två milliliter odlingsmedium. Med hjälp av en smal-bore, böjda sterila Pasteur pipett, pre-coat det med kultur medium, mekaniskt separera klumpar genom att försiktigt triturating fem till sex gånger. Låt de större klumparna nöja sig med ungefär en minut och överför den supernatant cellupphängningen till ett nytt 10 milliliterrör.
Upprepa denna process tre gånger till med ökande kraft trituration varje gång för att säkerställa nästan fullständig dissociation av SCGs. Överför supernatanten efter varje omgång trituration till 10 milliliterröret med supernatanten från den första triturationen. Lägg till tillräckligt med kulturmedier för att få volymen till åtta till tio milliliter.
Blanda försiktigt en cellfjädring och kvantifiera celltätheten med en hemocytometer. Fördela cellupphängningen i brunnarna vid lämplig celltäthet för experimenten. Blanda cellupphängningen kontinuerligt under pläteringsprocessen för att säkerställa jämn fördelning av celler i brunnarna.
För morfologisk analys, platta cellerna runt 8, 000 celler per brunn i en 24-brunnsplatta. Och för genomiska och proteomiska protokoll, platta cellerna så högt som 30, 000 celler per brunn. Överför plattorna till en glasutsikator med sterilt vatten i botten för att skapa en befuktad kammare.
Injicera tillräckligt med CO2, cirka 120 milliliter, för att få en 5%CO2-miljö i exsiccatorn, före försegling. Underhåll plattorna vid 35,5 grader Celsius. Detta kallas för dag noll i protokollet.
Dessa plattor kan också underhållas i en vanlig 5%CO2 inkubator. Den ovan beskrivna metoden minimerar temperatur- och pH-förändringar och hjälper även till att förhindra korskontaminering. Underhåll av de odlade SCG nervceller och behandlingar.
Dessa bilder visar de dissocierade överlägsna livmoderhalscancer ganglierna celler på dag noll, dag ett, och dag fem. Dagen noll bilden visar cellerna vid plätering. Cellerna pläterade på dag noll innehåller en blandning av både neuronala och icke-neuronala celler.
Dag ett, 24 timmar efter plätering, försiktigt bort hälften av odlingsmedia och ersätta med två mikromolar Ara-C, cytosin D-arabinofuranoside, en anti-mitotiska agent. Låt behandlingen vara kvar på cellerna i 48 timmar. Vanligtvis denna längd av behandlingen är tillräcklig för att eliminera icke-neuronala celler i kulturen.
På dag tre, försiktigt aspirera halva mediet och ersätta med kontrollmedium. På dag fyra är cellerna redo för experimentella behandlingar. Mata kulturer varannan dag med lämpligt medium.
Försiktigt ersätta hälften av mediet i brunnen med färskt medium. Bilden på dag fem visar omfattande axonal tillväxt med ingen dendritisk tillväxt observerats. För att inducera dendritisk tillväxt, nervceller kan odlas på Matrigel eller behandlas med 10%serum eller 50 nanogram per milliliter ben morphogenetic protein-7.
Figur två visar förändringar i neuronal morfologi av E21 råtta SCG nervceller efter behandling med BMP-7. Representativa faskontrastmikrografier vid 10 X förstoring visar den cirkulära neuronala cellkroppen med axoner i styrnerv i panel A, och nervceller med flera korta dendritliknande processer när de behandlas med BMP-7 som visas av pilarna i panel B.Odlade SCG nervceller efter lämpliga behandlingar kan användas för morfologiska behandlingar med hjälp av immuncytokemisk färgning för genomisk analys och för biokemiska studier , såsom för proteomiska analyser. Se manuskriptet för detaljerade protokoll för immunfärgning och provberedning för proteomisk analys.
Figur tre visar immunfärgning från MAP-2 protein i odlade embryonala råttor sympatiska nervceller. Panelerna A till D visar odlade SCG nervceller behandlas med kontroll media och paneler E genom H visar nervceller behandlas med BMP-7 på 50 nanogram per milliliter i fem dagar. Representativa mikrografer som visar immuncytokemiska färgning av nervcellerna med mikrotubuli associerat protein-2 i C och G, en nukleär fläck i D och H med fas kontrast mikrografer i B och F, och fram av de tre kanalerna i A och D.Immunocytochemical färgning från mikrotubuli associerade protein-2 är närvarande i cellkroppen och proximala axoner av kontroll nervceller i panel C.And färgning från MAP-2 protein i cellkroppen , och dendrites i BMP-7 behandlade nervceller är i panel G.Here's a sample run of superior cervical ganglia treated with control media, which detected 1, 100 proteiner.
Gen ontologi med hjälp av Panther databasen fann att de flesta av proteinerna var cytoplasmatiska. Det fanns dock membranbundna proteiner och proteiner vid cellulära korsningar i provet. Denna analys visade också att proteiner som är involverade i ett brett spektrum av neuronala signalering vägar upptäcktes i provet.
Sammanfattningsvis, efter att ha tittat på den här videon, bör du kunna isolera och kultur råtta embryonala överlägsen livmoderhalscancer ganglion nervceller för morfologiska och proteomisk analys. Detta arbete finansierades av fakulteten utvecklingsfonden och sommar forskningsprogram vid Saint Mary's College of California.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
