A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Culturing Rotte sympatiske nevroner fra embryonale overlegen cervical ganglia for morfologisk og proteomisk analyse
Chapters
Summary September 27th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dette papiret beskriver isolasjon og dyrking av embryonale rotte sympatiske nevroner fra de overlegne cervical ganglia. Det gir også detaljerte protokoller for immunocytokjemisk farging og for å forberede nevronale ekstrakter for massespektrometrisk analyse.
Transcript
I denne videoen vil vi demonstrere kulteringen av embryonale rotters overlegne cervical ganglia for morfologiske og proteomiske analyser. Før du begynner disseksjonen, forberede kontroll og disseksjon media. Kontrollmediet inneholder F-12 og lav glukose DMEM supplert med en insulin-selen-transferrin blanding, glutamin, nerve vekstfaktor, og BSA.
Disseksjonsmediet inneholder L-15 supplert med penne-strep og BSA. Se manuskriptet for detaljerte protokoller for medieforberedelse. Forberedelse av plater for å kultere nevroner.
Fortynn et ett mg per milliliter lager av poly-D-lysin til 100 mikrogram per milliliter med sterilt destillert vann. For proteomisk eller genomisk analyse, en til to dager før disseksjonen, belegge seks-brønnplater med ca. to milliliter sterile 100 gram per milliliter poly-D-lysin. Dette er nødvendig for å sikre celle vedheft til brønnen.
Pakk platene med plastfolie og lagre platene over natten på fire grader Celsius. På disseksjonsdagen, før disseksjonsstart, fjerner du poly-D-lysinløsningen fra brønnene og skylle brønnene fem ganger med sterilt destillert vann, etterfulgt av en gang med lav glukose DMEM. Under den enzymatiske fordøyelsen av ganglia, omtrent en time før plating cellene, aspirere DMEM fra platene og erstatte den med 0,3 milliliter kontrollmedium.
Oppbevar platene ved 35 grader Celsius under 5% CO2 i et fuktet kammer. Sett opp følgende elementer for disseksjon i panseret. Fire 50 milliliter sterile koniske rør med ca 20 milliliter disseksjonsmedier i hvert rør.
Fire sterile 35 millimeter retter med 1,5 milliliter disseksjonsmedier. En steril 50 milliliter konisk rør med 20 milliliter av disseksjonsmedier for sentrifugering. En 15 milliliter sterilt konisk rør for sentrifuging ganglia, en steril 10 milliliter rør for å samle dissosierte celler.
Bruk en tørr perler sterilisator for å sterilisere et par fine tang i minst ett minutt. Alle prosedyrer utført i studier som involverer dyr ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Saint Mary's College of California. Retningslinjene for dyrepleie og bruk ved Saint Mary's College of California ble utviklet basert på retningslinjer fra Office of Laboratory Animal Welfare ved National Institutes for Health.
Fjerning av E21 embryoer fra den gravide rotten. Vær oppmerksom på at fjerning av livmorhornet kan utføres utenfor panseret hvis det omkringliggende området er grundig sterilisert. Euthanize en gravid rotte med CO2 innånding.
Skjær pelsen fra bukregionen og tørk huden i området med 70% alkohol for å sterilisere den. Ved hjelp av et nytt sett med steril saks og tang, kutt gjennom huden og deretter muskelen for å avsløre livmorhornene som inneholder embryoene. Fjern livmorhornet med embryoene, ved hjelp av et nytt sett med saks og tang, og ta vare på å ikke skade tarmene i prosessen.
Overfør livmorhornet med embryoene til 150 millimeter steril petriskål og overfør dem til panseret. Bruk et nytt sett med tang og saks, fjern embryoene fra livmorhornet og skill embryoene fra fostervannsmembranene og morkaken. For å euthanize embryoene, kutt ryggmargen til embryoene langs midtlinjen under høyre arm.
Dette vil redusere blødningen fra halspulsåren under fjerning av SCG. Overfør disse embryoene til de tilberedte 50 milliliter koniske rørene som inneholder disseksjonsmedier. Kontroller at embryoene er nedsenket i media.
Hvert rør kan holde opptil tre embryoer. Isolering av den overlegne cervical ganglion fra embryoet. Overfør en valp fra disseksjonsmediet til en steril 150 millimeter petriskål halvfylt med solid substrat med sin dorsale overflate på underlaget.
Bruk tre sterile 23 gauge nåler, pin puben til parabolen med en nål under hver arm og en tredje nål gjennom munnen for å forsiktig hyperextend halsen. Skjær gjennom huden i nakkeområdet ved hjelp av sterile fine tang for å eksponere spyttkjertlene under. Fjern disse kjertlene ved hjelp av fine tang.
Finn sternocleidomastoid og omohyoid muskler nær kragebenet og luftrøret henholdsvis. Først kutte tverrgående sternocleidomastoid muskler. Og deretter forsiktig kutte den tynne omohyoid muskelen ved hjelp av fine tang.
Når disse musklene er fjernet, vil bifurcation i halspulsåren på den fremre enden være synlig på hver side av luftrøret med SCG plassert under denne gaffelen i halspulsåren. Bruk lukkede tang, løft forsiktig halspulsåren for å visualisere SCG. Bruk en tang på hver side av SCG, trekk ut halspulsen og overfør den til de tilberedte sterile 35 millimeterretter.
Dette vevet vil mest sannsynlig inneholde SCG med halspulsåren, vagusnerven med nodosegangliaene, samt andre segmenter av muskel eller fett i området. Gjenta disseksjonsprosessen på den andre siden. Fjern SCGs fra alle embryoer før du fortsetter med de gjenværende disseksjonstrinnene skissert.
Fordel det isolerte vevet mellom to av de 35 millimeter rettene for å lette behandlingen av vevsprøvene. Etterbehandling av SCG. For å skille SCG fra det dissekerte vevet, bruk først fine tang for å fjerne overflødig vev, for eksempel muskel eller fett, og vær forsiktig for å unngå området i nærheten av carotisbifurcation.
Når disse vevene er fjernet, er to ganglia synlige. Nodose ganglion er mindre og sirkulær mens SCG er mandelformet. Trekk forsiktig på vagusnerven for å skille vagusnerven og nodosegangene fra halspulsen og deretter skille SCG fra halspulsåren.
Bruk fine tang for å fjerne kapselen som omgir SCG. Overfør SCG til en ny 35 millimeter kulturrett. Gjenta denne prosessen med alle dissekerte vevsprøver.
Coat en sterilisert, bomull-plugget glass pipette med disseksjon media for å hindre vevet fra å følge pipette veggene. Bruk pipetten til å erstatte disseksjonsmediet med sterile to milliliter kollagennase type II, dispase type II i kalsium og magnesiumfri HBSS og inkubere i 50 minutter ved 37 grader Celsius for å bidra til å bryte ned vevet. Vær oppmerksom på at inkubasjonstidene kanskje må optimaliseres med forskjellige grupper av kollagennase /dispase og vanligvis varierer fra 40 minutter til en time.
Etter inkubasjonen, overføre SCGs og collagenase / dispase til en steril 15 milliliter konisk rør. Bruk disseksjonsmediet til å skylle platene og overføre løsningen til røret. Tilsett nok disseksjonsmedier for å bringe volumet til ca. 10 milliliter.
Sentrifuge ved 200 x g, 1, 000 til 1, 200 rpm i fem minutter ved romtemperatur for å pellet prøven. Aspirer den overnaturlige, ta vare på å ikke løsne pellet. Resuspend pellet med 10 milliliter av disseksjonsmedier, gjenta sentrifugeringen og kast det overnaturlige.
Erstatt med en til to milliliter kulturmedium. Bruk en smal-bore, bøyd-tip steril Pasteur pipette, pre-coat den med kultur medium, mekanisk dissosiere klumper ved forsiktig triturating fem til seks ganger. La de større klumpene bosette seg i omtrent ett minutt og overføre den overnaturlige cellefjæringen til et nytt 10 milliliter rør.
Gjenta denne prosessen tre ganger til med økende triturasjonskraft hver gang for å sikre nesten fullstendig dissosiasjon av SCGs. Overfør supernatanten etter hver runde med triturasjon til 10 milliliter røret med supernatant fra første triturasjon. Legg til nok kulturmedier til å bringe volumet til åtte til 10 milliliter.
Bland forsiktig en cellefjæring og kvantifisere celletettheten med et hemocytometer. Fordel cellesuspensjonen i brønnene ved riktig celletetthet for eksperimentene. Bland cellesuspensjonen kontinuerlig under platingprosessen for å sikre jevn fordeling av celler i brønnene.
For morfologisk analyse, plate cellene rundt 8000 celler per brønn i en 24-brønnplate. Og for genomiske og proteomiske protokoller, plate cellene så høyt som 30,000 celler per brønn. Overfør platene til en glassdesiccator med sterilt vann nederst for å skape et fuktet kammer.
Injiser nok CO2, rundt 120 milliliter, for å få et 5% CO2-miljø i desiccatoren, før tetning. Vedlikehold platene ved 35,5 grader Celsius. Dette kalles dag null i protokollen.
Disse platene kan også vedlikeholdes i en vanlig 5% CO2 inkubator. Metoden som er beskrevet ovenfor, minimerer temperatur- og pH-endringer og bidrar også til å forhindre krysskontaminering. Vedlikehold av de kultiverte SCG nevroner og behandlinger.
Disse bildene viser de dissosierte overlegne cervical ganglia cellene på dag null, dag én og dag fem. Dagen null bildet viser cellene ved plating. Cellene belagt på dag null inneholder en blanding av både nevronale og ikke-nevronale celler.
På dag én, 24 timer etter plating, fjern forsiktig halvparten av kulturmediene og erstatt med to mikromolar Ara-C, cytosin D-arabinofuranoside, et antimitotisk middel. La behandlingen stå på cellene i 48 timer. Vanligvis er denne lengden av behandlingen tilstrekkelig til å eliminere ikke-nevronale celler i kulturen.
På dag tre, forsiktig aspirere halvparten av mediet og erstatte med kontrollmedium. På dag fire er cellene klare for eksperimentelle behandlinger. Mate kulturer annenhver dag med riktig medium.
Forsiktig erstatte halvparten av mediet i brønnen med friskt medium. Bildet på dag fem viser omfattende aksonal vekst uten dendrittisk vekst observert. For å indusere dendrittisk vekst, kan nevroner dyrkes på Matrigel eller behandles med 10% serum eller 50 nanogram per milliliter beinmorfogenetisk protein-7.
Figur to viser endringer i nevronal morfologi av E21 rotte SCG nevroner etter behandling med BMP-7. Representative fasekontrastmikrografer ved 10 X forstørrelse viser den sirkulære nevronale cellekroppen med aksoner i kontrollnevroner i panel A, og nevroner med flere korte dendrittlignende prosesser når de behandles med BMP-7 vist av pilene i panel B.Cultured SCG-nevroner etter passende behandlinger kan brukes til morfologisk analyse ved hjelp av immunocytokmisk farging for genomisk analyse og for biokjemiske studier , for eksempel for proteomiske analyser. Se manuskriptet for detaljerte protokoller for immunstaining og prøveklargjøring for proteomisk analyse.
Figur tre viser immunstaining fra MAP-2 protein i kultiverte embryonale rotter sympatiske nevroner. Panel A til D viser kultiverte SCG-nevroner behandlet med kontrollmedier og paneler E gjennom H viser nevroner behandlet med BMP-7 ved 50 nanogram per milliliter i fem dager. Representative mikrografer som viser immunocytokjemisk farging av nevronene med mikrotubuli assosiert protein-2 i C og G, en kjernefysisk flekk i D og H med fasekontrastmikrografer i B og F, og fremvoksende av de tre kanalene i A og D.Immunocytokjemisk farging fra mikrotubulitilknede protein-2 er tilstede i cellekroppen og proksimale aksoner av kontrollnevroner i panel C.Og farging fra MAP-2 protein i cellekroppen , og dendritt i BMP-7 behandlede nevroner er i panel G.Her er en prøvekjøring av overlegen cervical ganglia behandlet med kontrollmedier, som oppdaget 1100 proteiner.
Genontologi ved hjelp av Panther-databasen fant at de fleste proteinene var cytoplasmatiske. Det var imidlertid membranbundne proteiner og proteiner ved cellulære veikryss i prøven. Denne analysen viste også at proteiner som er involvert i et bredt spekter av nevronale signalveier ble oppdaget i prøven.
Til slutt, etter å ha sett denne videoen, bør du kunne isolere og kultur rotte embryonale overlegen cervical ganglion nevroner for morfologiske og proteomisk analyse. Dette arbeidet ble finansiert av fakultetets utviklingsfond og sommerforskningsprogram ved Saint Mary's College of California.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
