Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Een geautomatiseerde differentiële nucleaire kleuringtest voor nauwkeurige bepaling van Mitocan Cytotoxicity
Chapters
Summary May 12th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Het protocol beschrijft een snelle, hoge doorvoer, betrouwbare, goedkope en onpartijdige test voor het efficiënt bepalen van cellulaire levensvatbaarheid. Deze test is vooral handig wanneer de mitochondriën van cellen zijn beschadigd, wat interfereert met andere tests. De test maakt gebruik van geautomatiseerd tellen van cellen bevlekt met twee nucleaire kleurstoffen - Hoechst 33342 en propidium jodide.
Transcript
Deze methode zal onderzoekers in staat stellen om cellulaire levensvatbaarheid onafhankelijk van mitochondriale functie te beoordelen. En het is vatbaar voor hoge doorvoer drug screening inspanningen. Deze techniek is snel, nauwkeurig, goedkoop, en maakt de bepaling van verbindingen cytotoxiciteit, met inbegrip van die afbreuk doen aan mitochondriale functie in de meeste soorten cellen.
Dit protocol is eenvoudig uit te voeren. Het is belangrijk om aandacht te besteden aan het geneesmiddelvoorbereiding, behandelingsomstandigheden en celdichtheid om experimentele nauwkeurigheid en geldigheid te garanderen. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk omdat het verkrijgen van afbeeldingen en beeldanalyse stappen kan moeilijk zijn om te recapituleren, vooral voor onderzoekers met weinig ervaring met Gen5 Software.
Begin met het voorbereiden van oplossingen van de verbindingen van belang bij de gewenste concentratie. Zorg er altijd voor om verbindingen te mengen door grondig te vortexen. Om cytotoxiciteit van een enkele verbinding te meten, bereid verbindingen voor bij 2X uiteindelijke concentratie.
Als u cytotoxiciteit van samengestelde combinaties meet, bereid ze dan voor op een 4X uiteindelijke concentratie. Bereid alleen oplosmiddelcontroles voor door dezelfde hoeveelheid oplosmiddel met het juiste medium te mengen. Verzamel cellen in een 15 milliliter conische buis en aliquot 10 microliter van de cel suspensie.
Voor trypan blauwe vlekken, voeg 10 microliter van 0,4%trypan blauw aan de aliquot en gebruik een hemocytometer of cel teller om levensvatbare en niet-levensvatbare cellen te tellen. Pelletcellen in de buis van 15 milliliter bij 200 keer G gedurende vijf minuten, dan aanzuigen of decamped de supernatant. We schorten de celpellet op in essay geschikte media bij een celdichtheid van drie keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter.
Gebruik een multi-channel pipet te zaad 50 microliter van cel suspensie in elke put van een 96 put plaat. Voor enkele samengestelde tests, voeg 50 microliter van 2x samengestelde oplossing in elke put. Voeg voor oplosmiddelbeheersingsputten 15 microliter testmedia toe die het oplosmiddel bij 2x-concentratie bevatten.
Voor combinatie tests voeg 25 microliter van elk van de 4X verbindingen in elke put. Voor enkele samengestelde controle putten, voeg 25 microliters elk van 4X samengestelde oplossing en testmedium. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van DMSO niet meer dan 0,5% om de reproduceerbaarheid te garanderen, voeg drugs met de pipette tips raken van de zijkant van putten.
Voorzichtig zijn om de drugs toe te voegen aan verschillende locaties. Deze steken moeten zeer snel worden uitgevoerd, bij voorkeur niet langer dan 30 minuten per plaat. Tik voorzichtig op de plaat om de inhoud van de putten te mengen en uit te broeden op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide.
Wanneer klaar om de cellen te bevlekken met Hoechst 33342 en propidium jodide bereiden verse 10X kleuring oplossing en voeg 10 microliters aan elke put. Tik voorzichtig op de plaat en broed het 15 minuten op 37 graden Celsius. Centrifugeren de plaat op 200 keer G gedurende vier minuten om alle cellen naar de bodem van de plaat te brengen.
Veeg vervolgens voorzichtig de onderkant van de plaat af met een vochtig laboratoriumdoek om vuil te verwijderen dat de beeldvorming kan verstoren. Beeld de plaat binnen 15 minuten na centrifugatie. Open Gen5 Software en maak een nieuw standaardprotocol, klik op Procedure en kies het type platen dat moet worden gebruikt.
Meestal, 96 goed zwarte plastic platen. Stel vervolgens de leesmethode in op afbeelding, klik op Ok en kies DAPI- en Texas Red Filter-sets met een 4X-vergrotingsdoelstelling. Er is geen offset nodig, omdat de putcentra in beeld worden gebeeldt.
Stel voor het DAPI-filter LED in op 10, de integratietijd op 99 en verkrijg deze tot nul. Voor Texas Red, set LED op acht, integratie tijd tot 950, en winst op 18. Klik op Opties om ervoor te zorgen dat de automatische focus wordt uitgevoerd op het DAPI-kanaal en er geen verschuiving is in het scherpstellen tussen kanalen.
Sla het protocol op door op Ok te klikken. Nu kunnen afbeeldingen worden opgenomen met de knop Nieuw lezen. Zodra afbeeldingen zijn opgenomen, klikt u op Gegevensreductie en kiest u Image Preprocessing.
Pas Image Preprocessing toe met donkere achtergrondaftrekken met automatische afvlakkingsgrootte op basis van het DAPI-signaal. Gebruik voor Texas Red dezelfde opties als voor Kanaal 1. Klik op Oke.
Ga vervolgens naar het cellulaire analysepaneel en pas een kernmasker toe op basis van het getransformeerde DAPI-signaal met een drempelwaarde van 6.000 eenheden, minimale objectgrootte van vijf micrometer en maximale objectgrootte van 25 micrometer. Analyseer de hele afbeelding, sluit primaire randobjecten op de rand van de afbeelding uit en splits aanraakobjecten. Stel in geavanceerde detectieopties de diameter van de rollende bal in op 30 micrometer en evalueer de achtergrond op basis van 5% van de laagste pixels.
Houd alleen het aantal cellen in berekende statistieken. Daarna voert u een subpopulatieanalyse uit op basis van het gemiddelde getransformeerde Texas Red-signaal met een drempelwaarde van 5.000 eenheden om dode cellen te tellen. Tot slot, toegang tot de resulterende cel telt.
Representatieve afbeeldingen van cellen bevlekt met Hoechst, propidium jodide worden hier getoond. Het totale aantal cellen is redelijk hoog en groter dan het aantal dode cellen. Wanneer een panel van cytotoxiciteitstesten werd vergeleken met trypan blauwe uitsluiting, bleek dat MTT en de Alamar blauwe test onnauwkeurig cellulaire levensvatbaarheid gemeten.
Deze mitochondriale enzym-gebaseerde testen toonden aanzienlijk lagere levensvatbaarheid in vergelijking met trypan blauwe uitsluiting. Dubbele kleuring met Hoechst 33342 en PI had de beste combinatie van robuustheid, gevoeligheid en consistentie met trypan blauwe kleuring en de kleinste mediane afwijking van de trypan blauwe uitsluiting methode na CCP of 2-DG behandeling. De Hoechst PI essay was ook effectief bij het bepalen van cellulaire levensvatbaarheid na behandeling met de mitochondriën gericht moleculen Rotenone en drie bromopyruvate.
Het werd verder gevalideerd met een paneel van leukemie cellijnen. Deze cellen varieerden in Rotenone gevoeligheid variërend van zeer gevoelig voor weerstand cellen. Onjuiste prestaties van de test kunnen de nauwkeurigheid ervan in gevaar brengen.
Verschillende gecompromitteerde uitkomsten worden hier getoond. Overstaining met PI, het verwaarlozen van de centrifugatie stap, of overbelichting in de Hoechst kanaal, zal leiden tot suboptimale resultaten. Terwijl de timing van dit protocol, vergeet niet om de kleurstof concentratie en kleuring tijd voor elke cellijn te optimaliseren.
Centrificatie voor een monsterplaat is ook noodzakelijk om de beeldkwaliteit te waarborgen. Na identificatie van verbindingen van cytotoxiciteit effect op kankercellen, onderzoekers kunnen doorgaan met mechanistische studies om hun relevante doelen te identificeren. Door kleine moleculenybliotheken te screenen met deze techniek parallel aan conventionele MTT-tests, kunnen moleculen die zich richten op mitochondriale functie snel worden geïdentificeerd.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
