Cancer Research
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मिटोकन साइटोटॉक्सीसिटी के सटीक निर्धारण के लिए एक स्वचालित अंतर परमाणु स्टेनिंग परख
Chapters
Summary May 12th, 2020
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प्रोटोकॉल कुशलतापूर्वक सेलुलर व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए एक तेजी से, उच्च थ्रूपुट, विश्वसनीय, सस्ती, और निष्पक्ष परख का वर्णन करता है। यह परख विशेष रूप से उपयोगी है जब कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रिया को नुकसान पहुंचा है, जो अन्य परखों में हस्तक्षेप करता है। परख दो परमाणु रंगों के साथ दाग कोशिकाओं की स्वचालित गिनती का उपयोग करता है-Hoechst ३४२ और प्रोपिडियम आयोडाइड ।
Transcript
यह विधि शोधकर्ताओं को माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन से स्वतंत्र रूप से सेलुलर व्यवहार्यता का आकलन करने की अनुमति देगी। और यह उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के प्रयासों के लिए उत्तरदायी है । यह तकनीक तेज, सटीक, सस्ती है, और अधिकांश कोशिकाओं प्रकारों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को ख़राब करने वाले यौगिकों साइटोटॉक्सीसिटी के निर्धारण की अनुमति देती है।
यह प्रोटोकॉल प्रदर्शन करना आसान है। प्रयोगात्मक सटीकता और वैधता सुनिश्चित करने के लिए दवा की तैयारी, उपचार की स्थिति और सेल घनत्व पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है। इस विधि का दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है क्योंकि छवि अधिग्रहण और छवि विश्लेषण कदम को फिर से काटना मुश्किल हो सकता है, खासकर Gen5 सॉफ्टवेयर के साथ थोड़ा अनुभव रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए।
वांछित एकाग्रता पर ब्याज के यौगिकों के समाधान तैयार करके शुरू करें। हमेशा अच्छी तरह से भंवर से यौगिकों को मिलाना सुनिश्चित करें। एक ही यौगिक की साइटोटॉक्सिक्सिटी को मापने के लिए, 2X अंतिम एकाग्रता पर यौगिक तैयार करें।
यदि यौगिक संयोजनों की साइटोटॉक्सिक्सिटी को मापते हैं, तो उन्हें 4X अंतिम एकाग्रता पर तैयार करें। सॉल्वेंट की समान मात्रा को उपयुक्त माध्यम के साथ मिलाकर केवल नियंत्रण तैयार करें। कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर शंकु नली में ले लीजिए और सेल निलंबन के 10 माइक्रोलीटर को अलीकोट करें।
ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग के लिए, एलिकोट में 0.4% ट्राइपैन ब्लू के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें और व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं को गिनने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर या सेल काउंटर का उपयोग करें। 15 मिलीलीटर ट्यूब में पैलेट कोशिकाएं 200 बार जी में पांच मिनट के लिए, फिर सुपरनेट को एस्पिरेट या डिकैरेप्ट करते हैं। हम निबंध उपयुक्त मीडिया में सेल गोली तीन बार 10 के सेल घनत्व पर पांचवीं कोशिकाओं को प्रति मिलीलीटर निलंबित ।
एक 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 50 माइक्रोलीटर बीज करने के लिए एक बहु-चैनल पिपेट का उपयोग करें। एकल यौगिक परख के लिए, प्रत्येक कुएं में 2X यौगिक समाधान के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। सॉल्वेंट कंट्रोल कुओं के लिए, 2X एकाग्रता पर सॉल्वेंट युक्त टेस्ट मीडिया के 15 माइक्रोलीटर जोड़ें।
संयोजन के लिए परख प्रत्येक अच्छी तरह से 4X यौगिकों में से प्रत्येक के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें। एकल यौगिक नियंत्रण कुओं के लिए, 4X यौगिक समाधान और परीक्षण माध्यम में से प्रत्येक में 25 माइक्रोलीटर जोड़ें। सुनिश्चित करें कि DMSO की अंतिम एकाग्रता 0.5% से अधिक नहीं है प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए, कुओं के पक्ष को छूने वाले पिपेट युक्तियों के साथ दवाओं को जोड़ें।
विभिन्न स्थानों पर दवाओं को जोड़ने के लिए सावधान रहना। इस छुरा बहुत जल्दी प्रदर्शन किया जाना चाहिए, अधिमानतः थाली प्रति 30 मिनट से अधिक नहीं ले । धीरे-धीरे कुओं की सामग्री को मिलाने के लिए प्लेट पर टैप करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट करें।
जब Hoechst 33342 और प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ कोशिकाओं को दाग करने के लिए तैयार ताजा 10X धुंधला समाधान तैयार करते हैं और प्रत्येक अच्छी तरह से 10 माइक्रोलीटर जोड़ते हैं। धीरे-धीरे प्लेट पर टैप करें और इसे 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सभी कोशिकाओं को प्लेट के नीचे लाने के लिए चार मिनट के लिए 200 बार जी पर प्लेट को सेंट्रलाइज करें।
फिर किसी भी मलबे को हटाने के लिए एक नम प्रयोगशाला पोंछ के साथ प्लेट के नीचे को ध्यान से मिटा दें जो इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकता है। अपकेंद्रित्र के बाद 15 मिनट के भीतर थाली छवि । Gen5 सॉफ्टवेयर खोलें और एक नया मानक प्रोटोकॉल बनाएं, प्रक्रिया पर क्लिक करें और उपयोग की जाने वाली प्लेटों के प्रकार का चयन करें।
आमतौर पर, 96 अच्छी तरह से काले प्लास्टिक की प्लेटें। इसके बाद, छवि के लिए पढ़ने की विधि सेट करें, ठीक क्लिक करें, और 4X आवर्धन उद्देश्य के साथ DAPI और टेक्सास रेड फ़िल्टर सेट चुनें। कोई ऑफसेट की जरूरत है, क्योंकि अच्छी तरह से केंद्रों छवि होगी ।
DAPI फिल्टर के लिए, 10 के लिए एलईडी सेट, एकीकरण का समय 99 करने के लिए, और शून्य करने के लिए लाभ। टेक्सास रेड के लिए, आठ के लिए एलईडी सेट, एकीकरण का समय 950 तक, और 18 तक लाभ। यह सुनिश्चित करने के लिए विकल्पों पर क्लिक करें कि ऑटो फोकस DAPI चैनल पर किया जाता है और चैनलों के बीच ध्यान केंद्रित करने में कोई ऑफसेट नहीं है।
ठीक क्लिक करके प्रोटोकॉल को बचाएं। अब छवियों को पढ़ें नए बटन का उपयोग कर दर्ज किया जा सकता है। एक बार इमेज रिकॉर्ड होने के बाद डेटा डिडक्शन पर क्लिक करें और इमेज प्रीप्रोसेसिंग चुनें।
DAPI सिग्नल के आधार पर ऑटो सपाट आकार का उपयोग कर अंधेरे पृष्ठभूमि घटाव के साथ छवि पूर्व प्रक्रिया लागू करें। टेक्सास रेड के लिए, चैनल 1 के लिए समान विकल्पों का उपयोग करें। समाप्त होने पर, ठीक क्लिक करें।
फिर सेलुलर विश्लेषण पैनल में जाएं और 6, 000 इकाइयों की सीमा मूल्य, पांच माइक्रोमीटर के न्यूनतम ऑब्जेक्ट आकार और 25 माइक्रोमीटर के अधिकतम ऑब्जेक्ट आकार के साथ परिवर्तित दापी सिग्नल के आधार पर एक परमाणु मुखौटा लागू करें। पूरी छवि का विश्लेषण करें, छवि की सीमा पर प्राथमिक किनारे की वस्तुओं को बाहर करें और स्पर्श करने वाली वस्तुओं को विभाजित करें। उन्नत पहचान विकल्पों में, रोलिंग बॉल व्यास को 30 माइक्रोमीटर के रूप में सेट करें, और सबसे कम पिक्सल के 5% के आधार पर पृष्ठभूमि का मूल्यांकन करें।
केवल सेल गणना मैट्रिक्स में गिनती रखें। उसके बाद, मृत कोशिकाओं की गिनती करने के लिए 5, 000 इकाइयों की सीमा मूल्य के साथ औसत रूपांतरित टेक्सास रेड सिग्नल के आधार पर एक उपजनसंख्या विश्लेषण करें। अंत में, परिणामस्वरूप सेल मायने रखता है का उपयोग करें।
होचस्ट, प्रोपिडियम आयोडाइड से सना हुआ कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां यहां दिखाई जाती हैं। कोशिकाओं की कुल संख्या काफी अधिक है और मृत कोशिकाओं की संख्या से अधिक है । जब साइटोटॉक्सिकिटी के एक पैनल की तुलना ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन से की गई थी, तो यह पाया गया कि एमटीटी और अलामार ब्लू परख गलत तरीके से सेलुलर व्यवहार्यता को मापा जाता है।
इन माइटोकॉन्ड्रियल एंजाइम आधारित परख ने ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन की तुलना में काफी कम व्यवहार्यता दिखाई। Hoechst 33342 और पीआई के साथ दोहरी धुंधला मजबूती, संवेदनशीलता का सबसे अच्छा संयोजन था, और ट्रिपन ब्लू धुंधला और सीसीपी या 2-डीजी उपचार के बाद ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन विधि से सबसे छोटी औसत विचलन के साथ स्थिरता। होचस्ट पीआई निबंध माइटोकॉन्ड्रिया के साथ उपचार के बाद सेलुलर व्यवहार्यता निर्धारित करने में भी प्रभावी था, जिसमें अणुओं रोटेनोन और तीन ब्रोमोप्रुवेट को लक्षित किया गया था।
इसे ल्यूकेमिया सेल लाइनों के एक पैनल के साथ आगे मान्य किया गया था। ये कोशिकाएं रोटेनोन संवेदनशीलता में भिन्न होती हैं जो प्रतिरोध कोशिकाओं के प्रति बहुत संवेदनशील होती हैं। परख का अनुचित प्रदर्शन इसकी सटीकता से समझौता कर सकता है।
कई समझौता परिणाम यहां दिखाए जाते हैं । पीआई के साथ ओवरसटिंग, अपकेंद्रित्र कदम की उपेक्षा, या Hoechst चैनल में ओवरएक्सपोजर, उप-क्षातिमल परिणाम का कारण बनेगा। इस प्रोटोकॉल को टाइमिंग करते समय, प्रत्येक सेल लाइन के लिए डाई एकाग्रता और धुंधला समय को अनुकूलित करना याद रखें।
इसके अलावा, इमेजिंग गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए एक नमूना प्लेट के लिए सेंट्रलिफिकेशन आवश्यक है। कैंसर कोशिकाओं पर साइटोटॉक्सिकिटी प्रभाव के यौगिकों की पहचान के बाद, शोधकर्ताओं ने अपने प्रासंगिक लक्ष्यों की पहचान करने के लिए यंत्रवादी अध्ययन के साथ आगे बढ़ सकते हैं । पारंपरिक एमटीटी परख के समानांतर इस तकनीक के साथ छोटे अणु पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग, अणुओं की अनुमति देगा जो माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को तेजी से पहचानने का लक्ष्य देते हैं।
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