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Dieses Protokoll wird bei der Etablierung und Aufrechterhaltung von gnotobitischen amerikanischen Kakerlaken (Periplaneta americana) verwendet, indem die Eierhüllen (Oothecae) vor dem Schlüpfen an der Oberfläche sterilisiert werden. Diese gnotobitischen Insekten enthalten ihre vertikal übertragenen Blattabacterium-Endosymbionten, haben aber axenische Eingeweide.
Das gnotobiotische Kakerlaken-Generierungsprotokoll erleichtert das Testen der Auswirkungen der Entfernung und des Ersatzes der nativen mikrobiellen Darmgemeinschaft auf die Gesundheit des Wirts und die Mikrobiom-Assemblierung. Diese Technik verwendet Methoden aus mehreren Quellen, um einen zusammenhängenden, optimierten Workflow für die Generierung von gnotobitischen Kakerlaken ohne den Einsatz teurer Speziallaborgeräte zu bilden. In Anbetracht der vielen verschiedenen beweglichen Teile dieses gnotobitischen Protokolls hilft die Visualisierung den Forschern, ihre eigenen kleinen, kostengünstigen, top-gnotobitischen Einrichtungen leichter zu etablieren.
Um das Sammeln der entsprechenden Anzahl von Weibchen, die Oothecae tragen, für die geplanten Experimente zu erleichtern, verwenden Sie eine Zette, um die Kartonröhren mit graviden Weibchen im Lagertank zu bewegen. Wenn eine Kartonröhre neben dem graviden Weibchen mehrere Insekten enthält, schütteln Sie den Rohrinhalt in einen zusätzlichen Kunststoffbehälter, der mit Vaseline umringt ist, und ermutigen Sie das Zielinsekt, allein in die Pappröhre zurückzuklettern. Nach der Abholung jede gravidierte Frau in die Entbindungsstation bringen.
Sobald die Weibchen ihre Ootheken fallen gelassen haben, bringen Sie die Weibchen in den Vorratstank zurück und verwenden Sie eine Zinnen, um die Ootheken aus dem Wurf zu holen. Um die Oothecae zu reinigen, legen Sie bis zu fünf Eiertuis in ein Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit drei Millilitern Natriumdodecylsulfat und wirbeln Sie die Oothecae für 10 Sekunden. Nach einer zweiten Wäsche, wie gerade gezeigt, verwenden Sie ein zartes Aufgabentuch, um die Oberfläche jeder Oothek sanft zu schrubben, um Ablagerungen zu entfernen und die gereinigte Ootheka in ein Wiegeboot zu legen.
Vor der Sterilisation zwei 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen pro Oothek mit einem Milliliter sterilem Wasser pro Röhrchen füllen. Fügen Sie auch 10 Mikroliter 32% Peressigsäure-Stammlösung zu 3,2 Millilitern doppelt destilliertem Wasser in einem Fünf-Milliliter-Zentrifugenrohr in einem Abzug hinzu. Verschluss und mehrmals umkehren, um zu mischen und bis zu fünf gereinigte Ootheken fünf Minuten lang in die frisch zubereitete 0,1% ige Peressigsäurelösung zu geben, wobei das Röhrchen mehrmals alle 60 Sekunden invertiert wird.
Peressigsäure ist ein starkes Oxidationsmittel gegen Augen, Haut und Atemwegsreizmittel und ist brennbar und ätzend. Tragen Sie während der Handhabung immer die richtige PSA und entsorgen Sie Ihre Abfälle sachgerecht. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine sterile Zette und eine Laminar-Flow-Haube, um jede Oothek in ein eigenes Zentrifugenrohr mit sterilem Spülwasser zu überführen.
Mehrmals umkehren, um zu mischen, bevor die Ootheka in den zweiten Satz Von Röhrchen mit Spülwasser übertragen werden. Nach dem zweiten Spülen verwenden Sie eine sterile Zwieder, um die Ootheka auf einzelne BHI-Slants zu übertragen. Legen Sie die Slants in einen sterilisierten Sekundärbehälter und bewegen Sie den Behälter vier bis fünf Wochen lang in einen befeuchteten 30-Grad-Celsius-Inkubator, bis er geschlüpft ist.
Überprüfen Sie die Slants regelmäßig ein bis zwei Mal pro Woche auf Pilz- oder Bakterienwachstum bis zur vierten Woche, dann sollten die Slants täglich überprüft werden. Wenn die Nymphen zu schlüpfen beginnen, verwenden Sie eine sterile Zette und eine laminare Strömungshaube, um ein Pellet sterilisiertes Rattenchow aseptisch in einen vorbereiteten BHI-Kolben zu übertragen. Stellen Sie als Sterilitätscheck den Kolben für 24 Stunden in den Sekundärbehälter im 30-Grad-Celsius-Inkubator, um ein fehlendes kontaminierendes Wachstum zu bestätigen.
Wenn der Kolben steril geblieben ist, schütteln Sie die Nymphen aus der Schräge und lassen Sie sie in den Kolben in der Laminar-Flow-Haube fallen. Dann gienen Sie die Nymphen einmal pro Woche mit 300 Mikrolitern sterilem Wasser in der Laminar-Flow-Haube. Wenn Nymphenkot beginnt, den mittleren Boden zu bedecken, übertragen Sie die Nymphen in einen neuen BHI-Kolben mit sterilisiertem Rattenchow, der 24 Stunden im Voraus hinzugefügt wird, wie gezeigt.
Schwangere Weibchen können durch die Oothek identifiziert werden, die an ihrem hinteren Bauch befestigt ist. Die Oothecae schlüpfen durchschnittlich 34 Tage nach der Sterilisation. In Fällen einer erfolglosen Sterilisation kann während der Inkubation wachstum um die Ootheken herum auftreten, was den gnotobitischen Status der Jungtiere beeinträchtigt.
Dann kann die Nymphenwachstumsrate durch Messung der Körperlänge des Insekts verfolgt werden. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus der 16S ribosomalen DNA aus einer homogenisierten Nymphe kann verwendet werden, um den gnotobiotischen Status zu bestätigen. Gnotobiotische Kakerlaken können mit synthetischen oder xenobiotischen mikrobiellen Gemeinschaften geimpft werden.
Während dieser spezielle Workflow neu ist, haben frühere Studien mit gnotobitischen Kakerlaken Einblicke in die Anordnung des Darmmikrobioms und die mikrobielle Rolle bei der Gestaltung des Sozialverhaltens, der Darmgesundheit und der Immunität ihrer Insektenwirte gewonnen.
