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항생제 치료 모기를 가진 세균성 구강 먹이 분석
Chapters
Summary September 12th, 2020
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이 문서는 모기 midgut 경작 미생물의 격리 및 식별, 모기 창자 박테리아의 항생제 고갈을 포함하여 개별 모기 창자 박테리아의 효력을 조사하고, 1개의 특정 박테리아 종을 재소개하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.
Transcript
모기 midgut 호스트 신진 대사에 영향을 미치는 미생물의 복잡 한 지역 사회를 항구, 재생, 피트 니스, 그리고 수 의사 능력. 각 창 자 미생물은 다른 효과. 이 비디오는 각 박테리아 긴장 또는 호스트 생리학의 각각의 역할을 연구하는 절차를 소개합니다.
장 세균 성 식민지의 문화를 취득하려면, 멸균 상태에서 모기 midgut을 해부. 해부 미드구트를 접고, 세로토요고를 하고, 한천 판 에 퍼짐. 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 16 개의 SRNA 유전자 서열을 통해 박테리아 종을 식별합니다.
장 내 미생물을 제거하기 위해 3 일 연속 항생제를 함유 한 COD 엠보스로 모기를 먹이. 항생제 치료의 효과는 후속 극단주의자 이전에 식민지 형성 단위 분석에 대한 무균 모기의 midgut를 해부함으로써 확인할 수 있습니다. 그런 다음 이전에 구강 수유 분석을 통해 모기 장에서 격리 된 특정 박테리아 종을 다시 소개합니다.
호스트 생리학에 박테리아의 효력은 처리되지 않은 모기, 항생제 처리한 모기 및 모기를 비교하여 평가될 수 있었습니다, 모기는 특정 구속을 재도입했습니다. 미드구트 해부와 재배 가능한 박테리아 격리. 우선, 수집 상자에 모기를 흡인기로 케이지에 모기를 수집하고 세포를 수집합니다.
3~5분 동안 4도의 온도에 복종하여 모기를 마취합니다. 모기를 얼음 차가운 페트리 접시에 넣음으로써 마취하십시오. 환경으로부터 박테리아에 의한 오염을 피하기 위해 75%에탄올을 살포하여 벤치를 소독하고 현미경을 해부하고 집게를 제거하십시오.
표면테이핑하여 75%에탄올로 3분간 흔들어 서 모기를 살균하고 PBS 버퍼로 두 번 헹구는 표면. PBS 한 방울이 들어 있는 멸균 유리 슬라이드에 모기를 따로 양분하십시오. 조심스럽게 집게를 사용하여 모기의 다리, 날개와 머리를 제거합니다.
모기의 가슴을 고정하고 복부의 마지막 부분은 집게하고 소화관을 격리하기 위해 떨어져 당겨. 집게를 사용하여 소화관에서 작물과 말피기안 튜브를 제거하십시오. 작물은 설탕 물을 섭취 한 후 midgut및 부푼 의 pnterior에 위치합니다.
말피기히안 튜브는 미드구트와 힌구트의 교차점의 날씬한 배설튜브 그룹입니다. 200 마이크로 리터 멸균 PBS 버퍼와 EP 튜브에 해부 메이크업을 배치하고 깨끗한 벤치에 멸균 연삭 목사와 분쇄. 시리얼은 LB 한천 판과 필사적 인 접시에 각 망상의 50 마이크로 리터에서 3 개의 템포 망상에 동종을로드합니다.
단일 식민지가 가능할 때까지 플레이트를 1~2일 동안 37도로 배양합니다. 단일 콜로니를 50 밀리리터 lb bras 배지가 들어 있는 150 밀리리터 원추형 플라스크로 선택합니다. 하룻밤 사이에 37도에서 박테리아를 흔들어.
종 식별. 세균성 게놈 DNA 생성 키트에 의해 토토 DNA를 추출하고 PCR에 의해 16 SRDNA를 증폭시킵니다. 암브로스 겔 전기포제와 운전 복구 키트에 의해 PCR 제품에서 DNA 단편의 회수 및 정제.
정제된 DNA 단편에 DNA 염기서열을 수행하여 달성된 박테리아 사슬 서열을 갖습니다. 박테리아및 고고학 및 데이터베이스에 대하여 박테리아를 식별하는 16SRNA 유전자 서열을 쿼리하여 폭발 검색을 실행한다. 종 수준에 대한 식별은 가장 가까운 팀 은행 진입과 99%16 SRDNA 서열 유사성보다 크거나 동일하다고 정의하였다.
상기 분리는 16SRDNA 서열일 때, 중형이 99% 미만이고 95%의 항생제 치료 및 박테리아 재도입에 상응하는 것으로 배부되었다. 우리에게 페니실린의 20 단위와 밀리리터 당 연쇄 절제술의 20 마이크로 그램을 시도 포함, 우리에게 10 % 자당 용액을 준비하기 위해 자당 페니실린과 연쇄 절제술의 필요한 양을 무게. 항생제를 함유한 자당 용액에 면봉에 침투하여 모기를 포함하는 종이 컵 위에 놓습니다.
10센티미터 페트리 접시로 면공을 덮어 해안가가 증발하는 것을 방지합니다. 하루에 두 번 면공을 교체하고 3 일 연속 모기를 공급합니다. 모기는 두 그룹으로 나뉩니다.
첫 번째 그룹은 치료없이 모기 컵에 배치되었다, 어떤 면봉 의사가 10 %그래서 십자가는 매일 주어졌다. 두 번째 그룹은 항생제로 치료되었고 3 일 동안 봉사했습니다. 각 그룹에서, 세르게이 모기는 해부되었다.
미카는 총 DNA 추출을 위해 추출되었고 QPCR은 범용 박테리아 프라이머를 사용하여 수행되었으며, 피규어 는 대조군 및 항생제 치료 군에서 16SRNA의 발현을 나타낸다. 결과는 페니실린과 연쇄상 구균의 비용 또는 실현이 성공했다는 것을 보여줍니다. 세균용 용액을 준비하고, 분광계로 바이러스의 박테리아 용액을 측정하고, EP 튜브에 OT 박테리아 서스펜션 1개를 추가합니다.
5, 000 RCA에서 5분 동안 서스펜션을 원심분리하여 4도에서 5분간 폐기하고, 멸균 PBS 버퍼로 박테리아 팔레트 시도를 세척한다. 200 마이크로리터 멸균 PBS 버퍼로 세균 팔레트를 다시 일시 중단하면 600 마이크로리터, 10% 자당 용액, 200 마이크로리터 ATP 및 200 마이크로리터 세균 현탁액을 새로운 AP 튜브에 넣고 잘 섞는다. 또는, 박테리아는 혈액을 활성화에 열에 다시 중단 될 수 있습니다.
가열 활성화 된 혈액의 준비. 항응고제 튜브와 신선한 혈액을 응고, 신선한 혈액의 2 ~ 3 밀리 리터를. 1000에서 10분 동안 혈장 과 혈액 세포를 분리하는 4도에서 원심분리기.
플라즈마를 새로운 EP 튜브로 수집하고 본원에서 1시간 동안 56도에서 활성화한다. 멸균 PBS 버퍼로 시간을 통해 폭발 집을 씻어. 린스는 가열 활성 플라즈마와 폭발 집을 중단.
멤브레인 및 공급 시스템을 조립합니다. 필름 병을 최대로 당깁니다. 플라스틱 링과 작업장 파라필름으로 고정하여 누출을 피하기 위해 서게 준비된 세균용 용액을 최대 지갑에 추가합니다.
거품이 한 방향에서 떨어졌을 않도록 피하고 피더 유닛을 밀봉합니다. 전원 공급 장치를 연결합니다. 온도가 37도에 도달 할 때까지 기다립니다 피더에 박테리아 용액피 장치를 설치.
박테리아 모기를 먹이기 전에 항생제를 대사하기 위해 24 시간 동안 중단해야합니다. 모기가 있는 종이 컵의 사료 장치의 경우 90분 동안 먹이를 허용합니다. 완전히 격려모기는 추가 연구를 위해 밖으로 골라질 수 있었습니다.
대표적인 결과. 그림 2는 우리에게 모기 당 평균 찬사를 보여줍니다. 항생제의 플롯 먹이 후 우리는 meningosepticum을 참조하십시오 모기를 치료.
도 3은 C meningosepticum을 포함하는 혈액 식사 후에 24 시간 변이체 발달 관련 유전자의 발현을 나타낸다. 결과는 대조군과 퇴색군의 계란 생산에 큰 변화가 없음을 보여줍니다. 박테리아에 관심이 있거나 항생제 치료 모기를 가진 수유 에세이에 관심을 가져 주셔서 감사합니다.
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