Genetics
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
CRISPR-Cas9-Gemedieerd Genoombewerking in de filamenteuze Ascomycete Huntiella omanensis
Chapters
Summary June 9th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Het CRISPR-Cas9 genoombewerkingssysteem is een gebruiksvriendelijke genoomeditor die is gebruikt in model- en niet-modelsoorten. Hier presenteren we een eiwit-gebaseerde versie van dit systeem dat werd gebruikt om een voortijdige stop codon te introduceren in een paring gen van een niet-model filamenteuze ascomycete schimmel.
Transcript
Ons protocol is belangrijk omdat het onderzoekers die werken aan niet-modelschimmels de mogelijkheid biedt om geavanceerde genoombewerkingstechnologieën in hun laboratoria vast te stellen. Aangezien het niet afhankelijk is van bestaande technieken, zoals expressiesystemen, heeft dit protocol het voordeel dat het gemakkelijker te vestigen is in niet-modelsystemen. Deze methode kan worden gebruikt over verschillende schimmelsoorten en kan worden gebruikt om functies van genen die betrokken zijn bij baan paring, groei, en pathogeniteit te verduidelijken.
Dus bij het uitvoeren van deze procedure, moet men er zeker van zijn om genoeg opeenvolgende dagen te hebben om het protocol te concurreren, omdat er slechts een paar punten in het experiment zijn waarop het kan worden onderbroken. Om de conidia te oogsten, filtert u de vloeibare cultuur door een laag steriele laboratoriumdoek in 50 milliliter centrifugebuizen voor centrifugatie. Resuspend de conidia pellet in vijf milliliter water en bekijk een 10 microliter aliquot van de conidia oplossing onder een lichtmicroscoop bij een 40X vergroting om te bevestigen dat alleen conidia zijn teruggevonden.
Voeg vervolgens 200 milliliter verse 1%moutextractbouillon toe aan een kolf van 500 milliliter en breng het volledige volume conidia over aan de kolf. Dan broeden de vloeibare cultuur voor maximaal 12 uur in een 25 graden Celsius schudden incubator op 120 omwentelingen per minuut. Om de kiemlingen te oogsten, breng de cultuur over op 50 milliliter centrifugebuizen voor centrifugatie en resuspend de kiemlingen in maximaal 10 milliliter van één molaire sorbitol.
Voeg een milliliter kiemoplossing toe aan verschillende concentraties enzymoplossing en broed de spoorenzymoplossing twee tot drie uur in de schuddende incubator toe bij 80 omwentelingen per minuut. Om de protoplasten te oogsten, filtert u de enzymoplossing door een laag steriele laboratoriumdoek en verzamelt u de protoplasten door middel van centrifugatie. Dan zorgvuldig resuspend de protoplast pellet in 200 microliters van STC buffer en controleer een 10 microliter aliquot van de oplossing onder een microscoop om te bevestigen dat alleen protoplasten zijn teruggevonden.
Om de transformatie te beginnen, combineer ongeveer vijf keer 10 tot de zes protoplasten met een enkel volume ribonucleoprotein-oplossing en ongeveer zes microgram van het donor-DNA-fragment. Gebruik vervolgens een pipet om langzaam en gelijkmatig een milliliter vers bereide 30%PTC-oplossing op de protoplastsuspensie te druppelen om een hydrofobe laag over de protoplasten te creëren en de oplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur uit te broeden. Voeg aan het einde van de incubatie vijf milliliter osmotisch controlemedium toe aan de protoplast-ophanging, die langzaam en voorzichtig wordt pipet om de oplossing grondig te mengen.
Na het mengen, incubeer de protoplast oplossing in de schudden incubator op 80 omwentelingen per minuut 's nachts. De volgende ochtend, verdeel de oplossing tussen vijf 60 millimeter cultuurplaten. Voeg 10 milliliter osmotische controle medium agar aangevuld met 30 microgram per milliliter Hygromycine B aan elke plaat en langzaam draaien elke plaat te mengen.
Laat de eerste laag van agar in te stellen voordat het toevoegen van 10 milliliter osmotische controle medium agar aangevuld met 40 microgram per milliliter van Hygromycine B twee elke plaat. Nadat de tweede laag van agar is ingesteld, broeden de culturen op 25 graden Celsius totdat enkele isolaten kunnen worden waargenomen groeien door beide lagen van agar. Om de met succes getransformeerde isolaten terug te krijgen, breng je de individuele groeigevuliseerde isolaten over op verse moutextract agarplaten aangevuld met 50 microgram per milliliter Hygromycine B.To de effecten van de gerichte genverstoring op de heterothallicische mogelijkheden van de schimmel te beoordelen, co-inentolaat van verse moutextract agar medium met één gemuteerde stam en een stam van het tegenovergestelde paringstype.
Bij het werken met H.omanensis, dek af, maar niet verzegelen van de platen. Plaats de platen zeven dagen op kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, visueel beoordelen voor de productie van seksuele structuren.
Om de homothalische vermogens van de gemuteerde stam te testen, inentubt het agar-medium van verse mout met de mutante stam van belang en incubeert u de plaat een week bij kamertemperatuur, zoals aangetoond. Om de effecten van de verstoring op de groeisnelheid van de schimmel die wordt bestudeerd te beoordelen, steek de achterkant van een grote steriele pipetpunt in de actief groeiende randen van de cultuur van elke mutant en wild-type stam van belang om mycelial-bedekte agar pluggen te creëren en inenting verse mout extract agar medium. Ten minste drie replicaties moeten worden gedaan per cultuurtype.
Na drie dagen van groei bij 20 graden Celsius, meet de groei in elke plaat op twee loodrechte diameters. Conidia gebruikt als uitgangspunt voor het protocol mogen ontkiemen en groeien totdat ze jonge kiemlingen. Merk op dat volwassen mycelial strengen zoals deze zijn te volwassen voor degradatie en mag niet worden gebruikt.
Wanneer de cellen geen celwanden meer hebben, worden ze zeer gevoelig voor mechanische verstoring en geven ze ronde protoplasten af die kunnen worden geoogst voor transformatie. Het succes van het protocol kan worden bevestigd op basis van een fenotypische analyse van de gemuteerde stammen. Voor dit gemuteerde MAT 127-isolaat werd de vegetatieve radiale groei aanzienlijk verlaagd, wat wijst op een pleiotropisch effect voor het nieuwe paringsgen.
Bovendien was het mutantenolaat niet in staat om een seksuele cyclus te voltooien die alleen onrijpe seksuele structuren produceerde die geen seksuele sporen produceerden in vergelijking met het wild-type isolaat dat de hele seksuele cyclus binnen een paar dagen na incubatie voltooide. RNA is zeer gevoelig en degradeert zeer gemakkelijk. Daarom zijn een schone werkomgeving en snel werken op ijs beide essentieel voor het succes van dit experiment.
Zodra mutant isolaat met succes zijn gegenereerd, kunnen ze worden onderworpen aan fenotypische of RNA-seq-analyse, indien van toepassing voor het gen dat wordt gekarakteriseerd.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
