Neuroscience
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从成人和老化小鼠的河马切片中尽量减少低氧
Chapters
Summary July 2nd, 2020
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这是一个急性切片制备从成人和老化的小鼠海马，利用转心灌注和切片切割与冰冷的NMDG-aCSF，以减少对组织的低氧损伤。生成的切片在几个小时内保持健康，并适用于长期的贴片夹和现场记录。
Transcript
这里提出的协议减少了成人和老化小鼠海马切片制备过程中的过度缺氧损伤，从而消除了研究成熟和老化神经回路功能的主要障碍。在无钠溶液中引入低温，可产生在切割后长达 10 小时的海马切片，适用于长期现场记录和贴片夹研究。这种制备海马切片的方法对于神经退行性疾病的动物模型特别相关，根据定义，这些动物模型需要老化的大脑准备。
该协议中最关键的一步是通过心电图通过心电图大量引入低温，并采用冰冷的溶液。通过一些实践，研究人员将能够可靠地执行此步骤。首先为恢复室和后续录音准备一升的 aCSF 解决方案。
然后准备300毫升的NMDG-aCSF的转心和切割步骤。将振动微切板切割托盘和安装盘放在零下 20 摄氏度的冰柜中。要准备恢复室，请将回收室填充到切片保持网格的上方，然后启动气泡器，将室室保持室温。
将整个 300 毫升 NMDG-aCSF 冷藏在冰柜中，直到冰晶开始在瓶子的表面和墙壁上形成。将瓶子与冷藏和NMDG-aCSF放在冰上，然后泡上，将溶液保持零至两摄氏度。将组织安装盘从冰柜中取出，并根据需要擦干。
切出一块5%的阿加大小，鼠标大脑，并粘在光盘的中心使用薄层的氰丙烯酸酯胶水。将带粘胶的盘放在冰上，用纸巾盖住，直到准备好使用。将切割托盘从冰柜中取出，放入显微原子中，然后用冰包围，然后装上刀片。
提前准备所有工具进行大脑解剖。设置用于转心灌注的心气吸管泵。用冰的 NMDG-aCSF 将泵管的一侧插入瓶子中，用 27 表针将另一侧安装。
将泵速设置为每分钟约 3.5 毫升。以这个速度，NMDG-aCSF 的流出是快速行程，而不是连续流。将鼠标放在尿布的背上。
在继续之前，通过执行一个手趾捏，确认小鼠在麻醉的手术平面上。鼠标应无响应，然后贴在其前腿和后腿上，使胸部和腹部暴露。切掉胸骨下到喉咙的一大片皮肤。
用钳子抓住胸骨，轻轻抬起胸骨，开始切开两侧的肋骨笼，直到胸腔暴露。切开隔膜，留下肋骨笼的皮瓣通过一块薄薄的肌肉连接。应该可以把它放在一边，而不会让它掉回暴露的胸腔上。
检查心脏是否仍在跳动，并确保大部分肝脏可见。将针头插入左心室，其颜色看起来比右侧浅。要稳定针头，请将针头穿过身体左侧的剩余肋骨。
找到深红色的右中庭，用小剪刀切开。血液应该开始流出。启动泵并观察肝脏，肝脏的颜色会从红色更改为棕色。
监测肝脏颜色并继续灌注，直到肝脏变成淡棕色。运行泵几分钟。动物的体温应该降至28至29摄氏度，鼻子应该冷到触摸。
用大斩首剪刀斩首鼠标，然后用10号刀片的手术刀切开头骨顶部的皮肤。用小角度剪刀，在中线切头骨。接下来，使用三号钳子撬开头骨的左右半部分，小心地用它带走杜拉。
取出大脑，用铲子挖出大脑，然后放入冰上NMDG-aCSF溶液中，将其取出。留在那里长达一分钟。将大脑从 NMDG-aCSF 中拿出来，放在一张滤纸上。
用 60 度工具从前脑角端的中线剪切并移除 60 度组织楔块。使用安装表面的切割边，因为它为海马切片提供了适当的角度。用手术刀将半球向下半球分离，并粘在安装盘上。
从冰上拿去安装盘，如果需要，擦干。然后将每个半球粘在阿加块前面，切面向下。确保两个半球的腹侧接触美洲狮块，并确保两个半球的后侧朝向刀片。
当粘在切割侧时，每个半球应相对于刀片的方向，以确保在原位位置的侧海马体的横向切片。将圆盘与半球一起淹没到含有冰冷碳化 NMDG-aCSF 的切割室中。切割 400 微米部分，然后使用带切断尖端的一次性转移移液器将切片转移到室温下含有碳化 NMDG-aCSF 的回收室。
继续切割其余部分，并将它们转移到恢复室，不超过 10 分钟，从后海马区总共切割 8 到 10 片。在室温下孵育切片约两小时，然后进行记录。该协议用于从成年小鼠生成海马切片。
在红外差分对比度显微镜下观察到，CA1 场和亚分细胞中的大量金字塔细胞以低对比度出现，这是健康细胞的标志。从6个月大的小鼠的CA1神经元中可以获取贴片夹记录。在下面的示例实验中，在NMDA-LTD相对于控制条件进行诱导后，测量了微型兴奋柱突触电流的频率。
NMDA-LTD 诱导后神经元中微缩兴奋后电流的频率较低，表明CA1中概要的活性依赖性修剪。未检测到振幅变化。在mEPSC记录期间，CA1细胞也充满了生物细胞素和完整的树突状，以及金字塔神经元的健康细胞习性在这里可以看到。
荧光染料在整个细胞中的强劲分布允许分析树突和树突脊柱在不同条件下。观察到CA3-CA1突触的长期强效，或LTP约170%，这表明，在成人小鼠准备的切片中，存在LTP所需的信号级联的维持。一个强大的现场兴奋后突触电位信号表明，网络连接也得到保留。
该协议的两个关键方面是通过冰冷的溶液进行转心，诱导体温过低，并在防止细胞毒性水肿的解决方案中引入NMDG作为钠离子替代品。使用这些预防措施，可以从任何大脑区域准备急性切片。此外，以这种方式准备的切片可用于使用双光子或宽场显微镜进行钙和电压成像。
该协议可以作为对来自老化动物的急性海马切片进行标准化准备的基础，从而促进神经退行性疾病机制背景下研究的比较。
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