Neuroscience
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वयस्क और उम्र बढ़ने चूहों से हिप्पोकैम्पस स्लाइस में हाइपोक्सिया को कम करना
Chapters
Summary July 2nd, 2020
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यह वयस्क और उम्र बढ़ने माउस हिप्पोकैम्पी से तीव्र टुकड़ा तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल है जो ऊतक को हाइपोक्सिक क्षति को कम करने के लिए बर्फ-ठंडे एनएमडीजी-एसीएसएफ के साथ ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन और स्लाइस कटिंग का लाभ उठाता है। जिसके परिणामस्वरूप स्लाइस कई घंटों में स्वस्थ रहते हैं, और दीर्घकालिक पैच-क्लैंप और फील्ड-रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त हैं।
Transcript
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल वयस्क और उम्र बढ़ने माउस हिप्पोकैम्पल स्लाइस की तैयारी के दौरान अत्यधिक हाइपोक्सिक क्षति को कम करता है, इस प्रकार परिपक्व और उम्र बढ़ने वाले तंत्रिका सर्किट के कार्य का अध्ययन करने के लिए एक बड़ी बाधा को दूर करता है। सोडियम मुक्त समाधानों में हाइपोथर्मिया का परिचय हिप्पोकैम्पस स्लाइस में परिणाम देता है जो दीर्घकालिक क्षेत्र-रिकॉर्डिंग और पैच-क्लैंप अध्ययन दोनों के लिए काटने और उपयुक्त होने के बाद 10 घंटे तक स्वस्थ रहते हैं। हिप्पोकैम्पल स्लाइस तैयार करने की यह विधि न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में पशु मॉडल के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हो सकती है कि परिभाषा के अनुसार एक उम्र बढ़ने वाले मस्तिष्क की तैयारी की आवश्यकता होती है।
इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम एक बर्फ ठंडा समाधान के साथ ट्रांसकार्डियल प्रचुरता के माध्यम से हाइपोथर्मिया शुरू कर रहा है । कुछ अभ्यास के साथ, शोधकर्ताओं को मज़बूती से इस कदम को निष्पादित करने में सक्षम हो जाएगा । वसूली कक्ष और बाद में रिकॉर्डिंग के लिए aCSF समाधान के एक लीटर तैयार करके शुरू करते हैं।
इसके बाद ट्रांसकार्डियल प्रोफेशन और कटिंग स्टेप्स के लिए एनएमडीजी-एसीएसएफ के 300 मिलीलीटर तैयार करें। वाइब्रेशन माइक्रोटॉम कटिंग ट्रे और माउंटिंग डिस्क को माइनस 20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें। वसूली कक्ष तैयार करने के लिए, यह सिर्फ टुकड़ा पकड़े जाल के ऊपर करने के लिए भरने के लिए और कमरे के तापमान पर बेंच पर चैंबर रखते हुए बबलर शुरू करते हैं ।
एक फ्रीजर में NMDG-aCSF के पूरे ३०० मिलीलीटर ठंडा जब तक बर्फ क्रिस्टल सतह और बोतल की दीवारों पर फार्म शुरू करते हैं । बोतल को ठंडा और एनएमडीजी-एसीएसएफ के साथ बर्फ पर रखें और इसे बुलबुला करें, शून्य और दो डिग्री सेल्सियस के बीच समाधान रखते हुए। टिश्यू माउंटिंग डिस्क को फ्रीजर से बाहर निकालें और जरूरत पड़ने पर उसे सूखा पोंछ लें ।
माउस मस्तिष्क के आकार के बारे में 5% एगर के ब्लॉक को काटें और इसे साइनोएक्रिलेट गोंद की पतली परत का उपयोग करके डिस्क के केंद्र में गोंद करें। बर्फ पर चिपके एगर के साथ डिस्क प्लेस और उपयोग करने के लिए तैयार होने तक कागज तौलिए के साथ इसे कवर करें। फ्रीजर से बाहर काटने ट्रे ले लो, यह माइक्रोटोम में जगह है, तो यह बर्फ के साथ चारों ओर और ब्लेड लोड ।
मस्तिष्क विच्छेदन के लिए समय से पहले सभी उपकरण तैयार करें। ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन के लिए पेरिस्टाल्टिक पंप स्थापित करें। आइस्ड एनएमडीजी-एसीएसएफ के साथ बोतल में पंप ट्यूबिंग के एक तरफ डालें और 27 गेज सुई के साथ दूसरी तरफ फिट करें।
प्रति मिनट लगभग 3.5 मिलीलीटर के लिए पंप की गति निर्धारित करें। इस रफ्तार से एनएमडीजी-एसीएसएफ का बहिर्गमन तेज यात्रा है, लगातार प्रवाह नहीं। माउस को उसकी पीठ पर डायपर पर रखें।
जारी रखने से पहले, पुष्टि की है कि माउस एक पंजे चुटकी प्रदर्शन करके संज्ञाहरण के एक शल्य विमान में है । माउस अनुत्तरदायी होना चाहिए, फिर इसके सामने और पिछले पैरों को टेप किया जाना चाहिए ताकि छाती और पेट सामने आ सके। छाती पर त्वचा का एक बड़ा पैच काटें, उरोस्थि के नीचे से गले तक जा रहे हैं।
संदंश के साथ उरोस्थि पकड़ो, इसे धीरे से उठाएं और छाती गुहा के उजागर होने तक दोनों तरफ रिब पिंजरे के माध्यम से काटना शुरू करें। डायाफ्राम के माध्यम से काटें, मांसपेशियों के एक पतले टुकड़े के माध्यम से संलग्न रिब पिंजरे का फ्लैप छोड़ दें। यह उजागर छाती गुहा पर वापस गिर बिना इसे अलग सेट करने के लिए संभव होना चाहिए ।
जांच करें कि दिल अभी भी धड़क रहा है और यह सुनिश्चित करें कि अधिकांश जिगर दिखाई दे रहा है। सुई को बाएं वेंट्रिकल में डालें, जो दाईं ओर से रंग में हल्का दिखता है। सुई को स्थिर करने के लिए, इसे शरीर के बाईं ओर शेष पसलियों के माध्यम से ड्राइव करें।
गहरे लाल रंग के दाहिने एट्रियम का पता लगाएं और छोटी कैंची के साथ इसके माध्यम से काटें। खून बाहर बहने लगा। पंप शुरू करें और जिगर का निरीक्षण करें, जो लाल से भूरे रंग में रंग बदल जाएगा।
जिगर के रंग की निगरानी करें और जब तक जिगर पीला भूरा हो जाता है परसेकना जारी रखें। पंप को कुछ और मिनटों के लिए चलाएं। जानवर के शरीर का तापमान 28 से 29 डिग्री सेल्सियस तक गिरना चाहिए और उसकी नाक को छूने के लिए ठंडा होना चाहिए।
बड़े डेपुटेशन कैंची के साथ माउस को काटना, फिर खोपड़ी के शीर्ष पर त्वचा को खोलने के लिए 10 नंबर ब्लेड के साथ एक स्केलपेल का उपयोग करें। छोटे कोण वाली कैंची के साथ, मिडलाइन पर खोपड़ी काटें। इसके बाद, खोपड़ी के दाएं और बाएं हिस्सों को दूर करने के लिए नंबर तीन संदंश का उपयोग करें, ड्यूरा को इसके साथ दूर ले जाने के लिए सावधान रहें।
मस्तिष्क को हटा दें, जो एक स्पैटुला के साथ इसे स्कूप करके एक ऑफ-व्हाइट रंग होना चाहिए और इसे बर्फ पर एनएमडीजी-aCSF समाधान में छोड़ दें। इसे एक मिनट तक के लिए छोड़ दें। मस्तिष्क को एनएमडीजी-एसीएसएफ से बाहर निकालकर फिल्टर पेपर के टुकड़े पर रखें।
कट और एक 60 डिग्री अग्रभाग के रोस्ट्रल अंत से मिडलाइन पर केंद्रित उपकरण के साथ ऊतक की एक 60 डिग्री कील हटा दें। बढ़ते सतह के कट पक्षों का उपयोग करें क्योंकि यह हिप्पोकैम्पस स्लाइस के लिए उचित कोण प्रदान करता है। गोलार्धों को स्केलपेल के साथ मिडलाइन के नीचे अलग करें और उन्हें बढ़ते डिस्क पर गोंद करें।
बर्फ से बढ़ते डिस्क ले लो और यह सूखी पोंछ, अगर जरूरत है। फिर आगर ब्लॉक के सामने प्रत्येक गोलार्द्ध गोंद, नीचे की ओर कट । सुनिश्चित करें कि दोनों गोलार्द्धों के वेंट्रल पक्ष आगर ब्लॉक को छू रहे हैं और दोनों गोलार्द्धों के पृष्ठीय पक्ष ब्लेड का सामना कर रहे हैं।
जब कट साइड पर चिपकाया जाता है, तो प्रत्येक गोलार्द्ध को ब्लेड के सापेक्ष एक तरह से उन्मुख किया जाना चाहिए जो सीटू में पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के ट्रांसवर्स स्लाइस सुनिश्चित करता है। बर्फ-ठंडे कार्बोजेनेटेड एनएमडीजी-एसीएफ युक्त एक काटने वाले कक्ष में गोलार्द्धों के साथ डिस्क को जलमग्न करें। एक 400 माइक्रोमीटर अनुभाग काटें, फिर कमरे के तापमान पर कार्बोजनेटेड एनएमडीजी-एसीएसएफ वाले रिकवरी चैंबर में स्लाइस स्थानांतरित करने के लिए कटऑफ टिप के साथ डिस्पोजेबल ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें।
बाकी वर्गों को काटना जारी रखें और उन्हें पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस क्षेत्र से कुल आठ से 10 स्लाइस काटने के लिए 10 मिनट से अधिक समय नहीं लेते हुए रिकवरी चैंबर में स्थानांतरित करें। रिकॉर्डिंग से पहले लगभग दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइस इनक्यूबेट। इस प्रोटोकॉल का उपयोग वयस्क चूहों से हिप्पोकैम्पल स्लाइस उत्पन्न करने के लिए किया गया था।
CA1 क्षेत्र और उपिकुलम में पिरामिड कोशिकाओं की बड़ी संख्या कम विपरीत, स्वस्थ कोशिकाओं की एक बानगी में दिखाई देते हैं, जब अवरक्त अंतर विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत मनाया जाता है। पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग चूहों के CA1 न्यूरॉन्स से प्राप्त की जा सकती है जो छह महीने से अधिक पुरानी हैं। यहां उदाहरण प्रयोग में, एनएमडीए-लिमिटेड को नियंत्रण स्थितियों के सापेक्ष प्रेरित किए जाने के बाद लघु उत्तेजक पोस्टसिनैप्टिक धाराओं की आवृत्ति को मापा गया था।
एनएमडीए-लिमिटेड इंडक्शन के बाद न्यूरॉन्स में लघु उत्तेजक पोस्टसिनैप्टिक धाराओं की आवृत्ति कम थी, जो CA1 में सारांश की गतिविधि निर्भर छंटाई का संकेत देती थी। आयाम में परिवर्तन का पता नहीं चला । mEPSC रिकॉर्डिंग के दौरान, CA1 कोशिकाओं को भी बायोसाइटिन भरा गया था और बरकरार dendritic आर्बर और पिरामिड न्यूरॉन्स के स्वस्थ सेल आदत यहां देखा जा सकता है ।
पूरे सेल में फ्लोरोसेंट डाई का एक मजबूत वितरण विभिन्न परिस्थितियों में डेंड्रिट्स और डेंड्रिटिक कताई के विश्लेषण की अनुमति देता है। लगभग 170% के CA3-CA1 synapses के दीर्घकालिक शक्तिशाली, या एलटीपी, देखा गया था, सुझाव है कि LTP के लिए आवश्यक सिग्नलिंग झरना का रखरखाव वयस्क चूहों से तैयार स्लाइस में मौजूद है। एक मजबूत क्षेत्र उत्तेजक पोस्टसिनैप्टिक संभावित संकेत से पता चलता है कि नेटवर्क कनेक्टिविटी को भी संरक्षित किया गया था।
प्रोटोकॉल के दो महत्वपूर्ण पहलू हाइपोथर्मिया को प्रेरित करने के लिए बर्फ-ठंडे समाधान के साथ ट्रांसकार्डियल प्रचुरता हैं और साइटोटॉक्सिक एडीमा को रोकने के लिए समाधानों में सोडियम आयन विकल्प के रूप में एनएमडीजी की शुरुआत करते हैं। इन सावधानियों का उपयोग करके, तीव्र स्लाइस किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र से तैयार किए जा सकते हैं। इसके अलावा, इस तरीके से तैयार स्लाइस का उपयोग दो फोटॉन या वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कैल्शियम और वोल्टेज इमेजिंग के लिए किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल उम्र बढ़ने वाले जानवरों से तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस के लिए एक मानकीकृत तैयारी के लिए एक आधार के रूप में काम कर सकता है और इस प्रकार न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग तंत्र के संदर्भ में अध्ययनों में तुलना की सुविधा प्रदान कर सकता है।
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