A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Модель клеточной культуры для изучения роли взаимодействия нейронов и глий в ишемии
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Здесь мы представляем простой подход с использованием конкретных средств культуры, что позволяет создание нейронов и астроцитов обогащенных культур, или нейрон-глии культур из эмбриональной коры, с высокой урожайностью и воспроизводимостью.
Transcript
Ишемический инсульт является клиническим состоянием, характеризующимся гипоперфузией тканей мозга и приводит к потере нейронов. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что взаимодействие между глией и писсуарными клетками оказывает давление после ишемического события. Для изучения потенциальных защитных механизмов важно разработать модели, позволяющие изучать взаимодействия нейронов и глии в ишемической среде.
Здесь мы представляем простой подход к изоляции астроцитов и нейронов от эмбриональной коры крыс, и что с помощью конкретных культурных сред позволяет создание нейронов или астроцитов обогащенных культур или нео-глии культур с высокой урожайностью и воспроизводимостью. Для изучения перекрестного стебля между астроцитами и нейронами, мы предлагаем подход, основанный на системе совместной культуры, в которой нейроны, культурные в крышках скользит поддерживаются в контакте с монослой астроцитов, покрыных в многофункциональных пластин. Эти две культуры поддерживаются частью небольших парафиновых сфер.
Такой подход позволяет независимые манипуляции и применение конкретного лечения для каждого типа клеток, что представляет собой преимущество во многих исследованиях. Чтобы имитировать то, что происходит во время ишемического инсульта, культуры подвергаются кислорода и глюкозы протокола лишения. Этот протокол представляет собой полезный инструмент для изучения роли нейронно-глийских взаимодействий в ишемическом инсульте.
Начните с изоляции эмбриональной коры крысы. Эмбрионы были получены из семьи крыс в 15 дней беременности и помещаются в стерильную трубку Falcon, содержащую PBS. Все еще внутри эмбрионов пакетика желтка помещены внутри чашки Петри, содержащей холодный PBS.
С помощью ножниц и пинцета желточный мешок нарушается, и эмбрион удаляется и помещается в другую чашку Петри, содержащую холодный PBS над пакетом со льдом. Необходимо быть очень осторожным при нарушении желточный мешок, чтобы не повредить эмбрион. Распоить эмбрион под рассечением микроскопа, аккуратно зафиксировать эмбрион с помощью twizzer.
Первоначальный разрез должен быть параллельным коре головного мозга. Будьте осторожны, чтобы не обезглавить животное. Кожу головы и тщательно удаляют, чтобы не повредить ткани коркового мозга.
Следующий разрез отделяет кору. Удалите кровеносные сосуды, присутствующие в ткани. Наконец, используя пипетку, перенесите корковую ткань в трубку Falcon с помощью PBS.
Одноклеточная суспензия получена путем механического пищеварения ткани головного мозга с помощью кончиков с уменьшением диаметра. Убедитесь, что ткань хорошо гомогенизирована После пищеварения, центрифуга материала на 400 Gs в течение трех минут. Откажитесь от супернатанта и ассизентьте осадок в среде культуры, предварительно разогретой до 37 градусов.
Рассчитайте общее количество ячеек, присутствующих в подвеске с помощью камеры Neubauer и препарировать разбавление для адекватной плотности клеток. Наконец, семена клеток в мульти-хорошо и инкубировать при 37 градусов. Для того, чтобы подготовить материал для системы совместной культуры, нагреть парафин в нагревательном блоке, пока он не станет жидким.
Затем с помощью стереостекла Пастер пипетка подготовить небольшие сферы над крышкой скользит, которые ранее были помещены в несколько хорошо, и покрыты Поли-D-Лизин. За 24 часа до того, как две культуры совесят, измените культурную среду нейронов и астроцитов, чтобы дополнить ее NBM тепловой инактивированной FBS или без нее. Когда две культуры будут готовы к использованию, перенесите нейрон, сидящий в крышке, скользит парафиновые сферы в скважины, содержащие астроциты с помощью пинцета, ранее погруженного в 70% этанола.
После размещения обоих типов клеток в контакте, ждать от восьми до 12 часов, а затем начать различные стимулы и процедуры. Лишение кислорода и глюкозы осуществляется в культуре с семи дней роста. Удалить культуру среды, и мыть клетки два раза с HBSS среды без добавок глюкозы.
Убедитесь, что вся среда, содержащая глюкозу, промывается. Печать Гипоксия камеры и добавить газовую смесь, содержащую 95% азота и 5%углекислого газа в течение четырех минут с потоком 20 литров в течение нескольких минут, с тем чтобы заменить кислород присутствует внутри камеры. Затем остановите поток и поместите камеру Гипоксии в инкубатор при 37 градусах.
После периода лишения кислорода и глюкозы, заменить средний, HBSS без добавок глюкозы с соответствующей среде культуры для остальных процедур и инкубировать клетки на 37 градусов. Для того, чтобы охарактеризовать тип корковой культуры, мы выполнили иммуногистохимию в трех типах корковых культур для оценки количества клеток, которые выразили GFPA или MAP2, которые являются маркерами широко используются для астроцитных и нейрональных клеток соответственно. Этот анализ показал, что, когда этот протокол, мы смогли получить чистую обогащенную культуру астроцитов с около 97% клеток, выражаюющих GFAP.
Что касается обогащенной нейронами культуры, мы проверили около 78% клеток, выражаюющих MAP2. Однако мы выявляем около 18% отрицательных ячеек GFAP и MAP2. Для нейронно-глиальной корковой культуры, Было отмечено, что около 49% клеток MAP2 положительные.
31% являются GFAP положительными. И 20% они не несут ответственности за GFAP или MAP2. Через семь дней после создания корковой культуры культура нейронов и обогащенная нейронами культура подвергались процедуре OGD в течение 4 и 6 часов.
После этой процедуры клетки были помечены MAP2, а затем количество положительных клеток MAP2 было количественно с помощью микроскопии флуоресценции. В нейронно-глиальной культуре наблюдалось снижение примерно на 30% числа нейронов, когда культура была представлена в период OGD 4 часа. После периода OGD 6 часов, расширение поражения увеличивается, достигнув около 60% от потери нейронов.
Что касается обогащенной культуры нейронов, подвергшихся воздействию OGD, было отмечено около 41% и 64% снижение числа клеток MAP2. Кроме того, было отмечено, что в обогащенной нейронами культуре, было небольшое увеличение увеличения травмы по сравнению с нейронно-глиальной культуры также подвергаются ОГД в течение 4 часов. В заключение, здесь представляют собой модель in vitro для изучения ишемического инсульта, установленного простым, быстрым, дорогим и воспроизводимым способом.
Кроме того, описанный метод также позволяет реализовать нейроны и обогащенные астроцитами первичные культуры, а также культуру нейронов-глий. Таким образом, обеспечивая большую модель in-vitro для моделирования нескольких заболеваний мозга с более высоким уровнем сложности, чем увековеченные клеточные линии и чистые нейронные или глиальные культуры.
Tags
Неврология Выпуск 165 Культура первичных клеток Крысиная эмбриональная кора Астроциты Нейроны Перекрестный разговор Нейрон-Глиа Ишемия Кислород и лишение глюкозыRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
