Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Cultuur van neurosferen afgeleid van de neurogene niches in Adult Prairie Voles
Chapters
Summary June 10th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
We stelden de voorwaarden voor de cultuur neurale voorloper cellen uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van de volwassen hersenen van prairie voles, als een aanvullende in vitro studie, om de seks-afhankelijke verschillen tussen neurogene niches die deel kunnen uitmaken van functionele plastic veranderingen in verband met sociaal gedrag te analyseren.
Transcript
Deze methode kan helpen om geslachtsafhankelijke verschillen in de neurogene niches te onderzoeken, en om hun neuroplasticiteit te begrijpen, veranderingen die sociale interacties in de prairievole onderstrepen. De test van neurosferen is een uitstekend hulpmiddel om de proliferatie en differentiatie potentieel van neurale stam en voorloper cellen te bepalen. Om te beginnen, plaats een petrischaal op een oppervlak omringd door ijs.
Deponeren de hersenen op de schotel en voeg 20 milliliter koude wasoplossing. In het coronale vlak, verdeel de hersenen in twee blokken weefsel met behulp van een scalpel, het uitvoeren van de snede op bregma niveau in de voorste achterste as. Haal de subventriculaire zone, of VZ, weefsel uit het rostral blok, en de dentate gyrus, of DG, weefsel uit het staartblok.
Om de VZ te ontleden, houd een van de hemisferen met een Dumont tang, en voeg de fijne uiteinden van een tweede tang onder het weefsel dat lijnen de caudate-putamen. Open de tang langs de rug-ventrale as om het weefsel te scheiden en verzamel de VZ in een centrifugebuis met twee milliliter koude wasoplossing. Pool het weefsel van meer dan twee dieren niet.
Herhaal de microdissection in het andere halfrond en bewaar de buis met het weefsel op ijs. Om het DG te ontleden, gebruik een scalpel om een coronale snede in het staartblok te maken, om twee plakjes te verkrijgen waarin de hippocampalvorming wordt waargenomen. Gebruik Dumont tangen om een van de plakjes te houden, en maak een horizontale snede tussen DG en CA1 met een andere tang.
Maak vervolgens een verticale incisie tussen het DG en CA3, om het DG te scheiden. Herhaal de dissectie in het andere halfrond van het eerste segment, dan in beide hemisferen in het tweede segment. Verzamel de vier DG-stukken van elke woelmuis in een centrifugebuis. Plaats de centrifugebuizen in de bioveiligheidskast en wacht ongeveer 10 minuten tot de weefselfragmenten door de zwaartekracht neerslaan.
Verwijder vervolgens de wasoplossing en voeg een milliliter warme enzymatische oplossing toe aan elke buis. Broed de buizen op 37 graden gedurende 10 minuten. Om de weefselfragmenten te desintegreren, pipette ze op en neer met een punt van één milliliter, maar niet meer dan 30 keer.
Herhaal de incubatie bij 37 graden Celsius en pipet het weefsel opnieuw. Voeg negen milliliter N-2 medium toe aan elke buis om de enzymatische behandeling te verdunnen en de buizen gedurende vier minuten op 200 keer g te centrifugeren. Gooi de supernatant weg, was de cellen met 10 milliliter N-2-medium en herhaal de centrifugatie.
Verwijder de supernatant uit elke buis, en resuspend de cel pellets van de VZ en DG in twee milliliter en een milliliter van de B-27 medium, respectievelijk. Filter elke celsuspensie met een celzeef van 40 micrometer om niet-verteerd weefsel te verwijderen. Kweek de gefilterde cellen in een ultralaage bevestigingsplaat 24-put, met behulp van twee putten voor de VZ en een put voor het DG. Voeg 20 nanogram per milliliter fibroblast groeifactor 2, en 20 nanogram per milliliter van epidermale groeifactor aan elke put, dan incubeer de plaat op 37 graden Celsius, 5%kooldioxide, en een hoge luchtvochtigheid voor 48 uur.
Na de incubatie, verwijder de helft van het kweekmedium en vervang het door vers B-27-medium, aangevuld met dubbele concentraties van de groeifactoren. Herhaal dit proces elke derde dag. Op dagen dat het niet nodig is om het kweekmedium te veranderen, voeg groeifactoren toe aan een uiteindelijke concentratie van 1X.
Neurosferen werden gevormd uit de neurale stamcellen geïsoleerd uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van zowel vrouwelijke als mannelijke volwassen prairie woelmuis. Hoewel er puin in de primaire cultuur was, waren alleen neurosferen aanwezig na de eerste passage. Een hoger aantal neurosferen werden verkregen uit de vrouwelijke subventriculaire zone dan uit de mannelijke subventriculaire zone, of de dentate gyrus van zowel vrouwen als mannen, wat suggereert dat het aantal verkregen neurosferen afhangt van de proliferative zone en het woelmuis.
De diameter van de neurosferen werd gemeten op dag 8, 11 en 14. Het steeg geleidelijk voor mannelijke en vrouwelijke woelmuis in beide neuronale gebieden, maar neurosferen afgeleid van de mannelijke hersenen waren kleiner in vergelijking met die afkomstig van de vrouwelijke hersenen. Aanhangende neurosferen werden gekenmerkt op dag zes in aanwezigheid van groeifactoren, of op dag 15 zonder groeifactoren.
Op dag zes, onder ongedifferentieerde omstandigheden, drukten de neurosfeer-afgeleide cellen Nestin uit, een marker voor neurale voorouders. Het was ook mogelijk om dubbelcortine-positieve cellen en de proliferatiemarker Ki-67 te identificeren, die wijzen op de aanwezigheid van neuronale precursoren of onrijpe neuronen. Echter, het gebrek aan colocalisatie van Ki-67 met DCX suggereerde de aanwezigheid van post-mitotische neuroblasten.
Op dag 15 werden onder differentiatieomstandigheden volwassen neuronen en cellen met het gliafenotype gevonden, wat het differentiatiepotentieel van de geïsoleerde cellen aantoonde. Bij een poging van dit protocol, in gedachten houden dat de mogelijkheid om te herkennen en met eerdere praktijk in microdissection is van fundamenteel belang om alleen cellen te isoleren van de neurogene niches. Volgens dit protocol kunnen experimenten worden ontworpen om mechanismen te identificeren die betrokken zijn bij proliferatie, differentiatie en overleving van neurale stam- en voorlopercellen, processen die nog onbekend zijn in de prairievole.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
