Immunology and Infection
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Analisi del metabolismo delle cellule dell'assassino naturale umano
Chapters
Summary June 22nd, 2020
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In questo articolo, descriviamo un metodo per misurare la glicolysi e la respirazione mitocondriale nelle cellule dell'assassino naturale umano primario (NK) isolate dal sangue periferico, a riposo o dopo l'attivazione indotta da IL15. Il protocollo descritto potrebbe essere facilmente esteso alle cellule NK umane primarie attivate da altre citochine o stimoli solubili.
Transcript
Questo metodo consente la determinazione del metabolismo delle cellule killer naturali. Un parametro chiave nell'attivazione misurando il consumo di ossigeno e le variazioni di pH nel mezzo extracellulare. Il vantaggio dell'analizzatore di flusso extracellulare è che è completamente automatizzato e in grado di testare fino a 92 campioni in tempo reale con basse quantità di cellule.
Consentendo così schermi ad alta velocità effettiva. Un metodo valido per determinare la glicolisi e la respirazione nelle cellule inchio cimiche è molto importante in clinica. Poiché ci sono molte malattie tra cui l'obesità e il cancro in cui il metabolismo delle cellule ralchi è compromesso.
Inizia con pipettare 20 millilitri di mezzo di separazione dei linfociti in un tubo conico da 50 millilitri. Mantenendo il tubo ad un angolo di 30 gradi, pipettare delicatamente 20 millilitri di sangue sul mezzo. Creazione di un'interfaccia visibile e ben definita tra i due fluidi.
Centrifugare i tubi per 25 minuti a 1000 volte G.Quindi eserti con cura i tubi dalla centrifuga e metterli in un rack. Verificare la presenza di uno strato cospicuo di cellule all'interfaccia tra LSM e plasma. Aspirare delicatamente lo strato di cella mononucleare con una pipetta di plastica da 10 millilitri e posizionarlo in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.
Lavare le cellule mononucleari due volte con 45 millilitri di PBS. E centrifugarli a 800 volte G per cinque minuti. Per isolare le cellule killer naturali o gli engavi, contare i mari PVM e rimescolarli nel buffer di separazione NK a una volta da 10 a ottava celle per millilitro.
Quindi trasferire 10 millilitri della sospensione cellulare in un nuovo tubo da 50 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di miscela di anticorpi di isolamento cellulare NK. E 10 microlitri di anticorpi di isolamento positivi anti CD si mescolano ai PBBC.
E incubarli a temperatura ambiente per 10 minuti. Perline magnetiche a vortice e aggiungere un millilitro ai PBBC e agli anticorpi. Quindi incubare il MIGS per 10 minuti a temperatura ambiente con agitazione occasionale.
Aggiungere 35 millilitri di tampone di isolamento NK e posizionare il tubo sul magnete per 15 minuti. Raccogliere con cura il supernatante con una pipetta di plastica da 50 millilitri senza toccare i lati o il fondo del tubo. Contare le cellule e centrifugarle a 800 volte G per cinque minuti.
Per stimolare le cellule NK con corridoio solubile 15, rimostrare 750.000 cellule in 100 microlitri di IMDM contenenti il 10%HS in un pozzo di una piastra di 96 polacche. Diluire il corridoio umano da 15 a un microgrammo per millilitro nell'IMDM e il 10%HS. E aggiungere 100 microlitri del corridoio umano diluito 15 alle cellule.
Riparare un campione di controllo con celle non stimolate e posizionare entrambi i campioni nell'incubatore a 37 gradi Celsius. Stimolare le cellule per 48 ore, quindi eseguire il test del flusso extracellulare. Il giorno prima dell'esperimento, accendere l'analizzatore e lasciarlo riscaldare fino a 37 gradi Celsius.
Aprire il pacchetto della cartuccia di censura e separare la cartuccia dalla piastra di utilità. Quindi aggiungere 200 microlitri della soluzione di calibrant ad ogni pozzo della piastra di utilità. E rimettere la cartuccia centrale per assicurarsi che i sensori siano completamente sommersi.
Per risultati ottimali incubare la cartuccia durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore privo di anidride carbonica. Che correttamente umidificato. Per preparare una lama rivestita adesiva, pipettare 25 microlitri della soluzione adesiva cellulare ad ogni pozzo della piastra.
E incubato a temperatura ambiente per 20 minuti. Quindi rimuovere la soluzione e lavare la piastra due volte con 200 microlitri di acqua sterile per pozzo. Tenere la piastra aperta per 15 minuti all'interno del cappuccio di coltura cellulare per consentire ai pozzi di asciugarsi.
Centrifugare le celle NK precedentemente isolate aggiungere 200 volte G per cinque minuti. Quindi rimuovere i supernatanti e lavare le cellule in mezzo di prova di stress mitocondriale riscaldato o mezzo di prova di stress per glicolisi. Pellettare nuovamente le cellule e rimornerle alla concentrazione cellulare preferita nello stesso mezzo.
Posare 180 microlitri di sospensione cellulare per pozzo nella piastra di dosaggio. Utilizzare pozzi A uno, A 12 H uno e H 12 come pozzi di controllo per la correzione dello sfondo. Aggiungendo 180 microlitri del mezzo di dosaggio a questi pozzi incubare la piastra per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore privo di anidride carbonica.
Centrifugare la piastra a 200 volte G per cinque minuti. Quindi osservare le cellule al microscopio per verificare che formino uno strato di mano nella parte inferiore del pozzo. Incubare le cellule per altri 25 minuti.
Soluzioni di lavoro calde a 37 gradi Celsius. E riadatta il loro pH a 7,4 se necessario. Caricare i composti precedentemente preparati per una prova di stress mitocondriale o per una prova di stress da glicolisi nelle schede A, B e C della cartuccia di censura idratata Rimettere la cartuccia di censura caricata nell'incubatrice durante l'impostazione del programma.
Per impostare il protocollo di dosaggio del flusso extracellulare, aprire il software e utilizzare le definizioni di gruppo per definire le condizioni di pretrattamento. Utilizzare la scheda Mappa piastra per indicare i gruppi di pozzi che hanno condizioni simili Indicare anche la correzione dello sfondo e i pozzi vuoti. Quindi impostare il programma nella scheda protocolli.
Avviare il programma e posizionare la cartuccia del sensore e la piastra di utilità sul vassoio. Dopo la fase di calibrazione, sostituire la piastra di calibrant per la piastra di dosaggio con le celle attaccate. Una volta completata l'esecuzione, recuperare i dati e analizzarli.
Al fine di valutare la purezza e la vitalità delle cellule NK. I piccoli Alec Watt dei mari PVM e la popolazione isolata di cellule NK sono stati macchiati e analizzati dalla citometria a flusso. La purezza della popolazione cellulare NK è stata stabilita rimanendo doppiamente contro CD tre e CD 56 o NKP 46.
Un sacco di tasso di consumo di ossigeno mitocondriale per le cellule NK umane sono mostrati qui. Come previsto, i numeri di cella I mostrassero valori OCR più elevati. I numeri cellulari sono anche correlati linearmente con la quantità di DNA o proteine nel pozzo.
D'altra parte, numeri di cella più alti non erano ottimali. Perché dopo l'aggiunta di DNP, la concentrazione di ossigeno nel pozzo era totalmente esaurita in ogni ciclo. Il che ha impedito il calcolo accurato dell'OCR.
Nelle cellule NK umane, 100 DNP micromolare sono risultati essere la dose ottimale. Qui viene mostrato un tipico esperimento di stress test mitocondriale con 750.000 cellule NK per pozzo. In questo test l'oligomicina porta ad una drammatica diminuzione del consumo di ossigeno.
E un aumento dell'ECAR. Che rappresenta un passaggio alla glicolisi e uno sforzo per mantenere i livelli di ATP cellulare. L'attivazione delle cellule NK da parte del corridoio 15 ha causato un aumento sia del consumo mitocondriale di ossigeno che dell'acidificazione extracellulare.
La respirazione basale massima e atp è aumentata, ma non la perdita di protoni o la respirazione non mitocondriale. Inoltre, il tasso OCR/ECA è diminuito Indicando uno spostamento verso un metabolismo glicolitico dopo la stimolazione il 15. Quando si esegue questo protocollo, è molto importante ottenere una popolazione cellulare pura e sana per determinare il numero di cellule ottimale e titolare la concentrazione di incavibili.
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