Environment
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Påvisning av Phytophthora capsici i vanning vanning vann ved hjelp av Loop-mediert isotermisk forsterkning
Chapters
Summary June 25th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi utviklet en metode for å oppdage Phytophthora capsici zoospores i vannkilder ved hjelp av en filterpapir DNA ekstraksjon metode kombinert med en loop-mediert isothermal forsterkning (LAMP) analyse som kan analyseres i feltet eller i laboratoriet.
Transcript
Phytopathogen deteksjon er et avgjørende skritt i plantesykdomsbehandling. Denne protokollen gir en rask deteksjonsmetode for vanning vannforurensning på grunn av en vanlig vannbåren fighter patogen. Ved hjelp av denne teknikken kan spesifikt patogen, som Phytophthora capcici, behandles og oppdages raskt fra vårt store volum vanningsvann mens du er på stedet.
Viser prosedyren vil være Owen Hudson, en Masters student fra laboratoriet mitt, og Sumyya Waliullah, en postdoktor forsker fra Dr.Pingxi G laboratorium for å sette opp en pumpe og filter for på stedet Phytophthora capcici deteksjon i vanning vann. Fest en filtreringskolbe til et rør som er koblet til en håndpumpe og montert buchnertrakt i gummiproppen i munnen på filtreringskolben. Monter deretter et filterpapir i riktig størrelse med en 15 mikron oppbevaringsstørrelse i trakten.
For å få vannprøver samle vanning vann fra den målrettede kilden. Vannet kan ha små mengder rusk, men ikke betydelig sediment eller jord. Hell sakte mellom 50 og 1000 milliliter testvann over filterpapiret inne i trakten mens du bruker håndpumpen til å lage en suge for å trekke vannet gjennom trakten.
Når alt vannet er filtrert, bruker du tang til å fjerne filterpapiret fra trakten. Og bruk steril saks for å kutte papiret i små biter. Senk åtte til 12 papirbiter i 400 mikroliter ekstraksjonsbuffer i et 1,5 milliliter rør i en fem minutters inkubasjon ved romtemperatur.
Vortex eller på annen måte røre papiret i 10 sekunder en gang hvert minutt. På slutten av inkubasjonen, bruk tang til å fjerne papiret med så lite buffer som mulig. Og gjenta lisensen med neste sett med filterpapirstykker.
For DNA-ekstraksjon fra filterpapirprøvene la 20 mikroliter proteiner K og 10 mikroliter på 10 nanogram per mikroliter RNAer til prøven også og inkubere løsningen ved romtemperatur i 15 minutter med vortexing eller risting hvert tredje minutt. På slutten av inkubasjonen legger du til 500 mikroliter magnetiske perler i bindingsbuffer til prøven og bland godt ved å riste. Etter fem minutter ved romtemperatur plasserer du røret og magnetskillestativet i to minutter før du fjerner og kaster overnatanten.
Fjern røret fra magnetseparatoren og trekk forsiktig perlene i 500 mikroliter vaskebuffer. Etter 30 sekunder går røret tilbake til magneten og venter to minutter før du kaster det overnaturlige. Gjenta vasken med 500 mikroliter vaskebuffer også og 500 mikroliter på 80% etanol som nettopp demonstrert.
Og luftdeter den magnetiske perlepelleten i 15 minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen re-suspendere perlene i 50 mikroliter av elution buffer med pipettering i ett minutt før du plasserer røret tilbake på magneten i to minutter for å tillate samling av supernatant. Etter å ha klargjørt LAMP primer mix som angitt i tabellen, tilsett på 2,5 mikroliter primer blanding 12,5 mikroliter av en lava LAMP mastermix en mikroliter av ekstrahert DNA og ni mikroliter av dobbelt destillert vann til et PCR-rør og sette opp en positiv og en negativ kontroll.
inkubere alle prøvene i en 64 grader Celsius varmeblogg i 45 minutter eller genie tre forsterkningsinstrument på slutten av inkubasjonen, en last på fem mikroliter av hver forsterket prøve på en 1% agarose gel og bilde de resulterende båndene på en ultrafiolett bildemaskin. Hvis et kalorimetrisk fargestoff ble brukt, kan du se fargeendringen for å bestemme resultatene som positive eller negative. Hvis et bærbart forsterkningsinstrument ble brukt, kan du vise forsterkningsgrafen på skjermen for å finne resultatene.
Den optiske tiden for å kjøre LAMP-analysen ved 64 grader er 45 minutter, da de laveste konsentrasjonene som var positive for deteksjon, ikke forsterkes før 40 minutter, mens høyere konsentrasjoner forsterkes ved 20 minutter. Forsterkning kan bekreftes på en 1% agarose gel merket med en nukleinsyre flekk. Som illustrert er konvensjonell PCR 40 ganger mindre følsom enn LAMP.
Oppdage 4,8 ganger 10 til de tredje zoospores per milliliter konsentrasjoner på det laveste. I denne analysen ble vannprøver samlet inn fra syv dammer som brukes til kommersiell grønnsaksproduksjon i Tift County, Georgia. Tre av disse viste positive LAMP-resultater.
Når prøvene ble testet av konvensjonelle PCR ble imidlertid dyresporer oppdaget i bare en av de tre positive prøvene. I denne tabellen oppsummeres forskjellene mellom gjenkjenningsmetoder ved hjelp av variabler som følsomhet, tid, nødvendig forberedelse, materialer og kostnader. LAMP er den billigste metoden blant de testede metodene, og er også den raskeste, som krever bare 30 til 60 minutter for forsterkning sammenlignet med konvensjonell PCR-forsterkning.
Ved hjelp av denne protokollen DNA ekstrahert fra nært beslektede UMI frø patogener resulterer i ingen deteksjon for noen av prøvene, bekrefter spesifisitet av primere. Pass på at du ikke heller prøvevannet for fort og vær forsiktig når du legger ut ekstrahert DNA til LAMP-rørene for å begrense kontaminering. Når andre vannbårne patogener har fått sine spesifikke primersett utviklet, kan filtrerings- og lampesyremetodene tilpasses andre patogener.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
