Um novo paradigma de condicionamento do medo pavloviano para estudar o congelamento e o comportamento de voo

O objetivo geral desse paradigma é avaliar o comportamento defensivo complexo dos roedores. Esse protocolo é significativo porque facilita as investigações sobre as transições entre comportamentos defensivos, tornando-o ideal para pesquisadores interessados em estudar respostas adaptativas complexas à ameaça. Este protocolo usa estímulos de condição temporariamente precisos para provocar transição entre respostas defensivas, permitindo-nos estudar ambos, congelamento condicionado e comportamentos de voo dentro de indivíduos.

O uso desse modelo para descobrir os mecanismos do comportamento defensivo pode fornecer insights sobre disfunção relacionada ao TEPT e distúrbios do pânico e pode ajudar no desenvolvimento de novas terapêuticas. Para configurar os protocolos comportamentais, no programa, defina o SCS, definindo os estímulos a serem entregues como um tom puro de dez segundos, ou um ruído branco de dez segundos, e definindo os intervalos de inter-ensaio a serem apresentados pseudo-aleatoriamente após cada ensaio. Para configurar o rastreamento do software, coloque um mouse de teste em cada contexto relevante, defina o centro de gravidade e ajuste o tamanho do contorno.

Use o tamanho das câmaras e as dimensões dos pixels da câmera para determinar o coeficiente de calibração. Em seguida, gere o código de pulso TTL para sincronizar os marcadores de eventos do computador central às suas ocorrências em tempo real. Antes de iniciar um experimento, ligue o controlador de caixa de condicionamento de medo, o shocker e o software de gravação de vídeo.

Monte um alto-falante sobre a sobrecarga acima dos contextos para entrega dos estímulos auditivos em 75 decibéis, e defina um gerador de áudio programável para gerar estímulos auditivos em um cronograma predefinido. Depois de confirmar que o Tom e o Ruído Branco estão funcionais, defina o sistema para aquisição de dados e transporte ratos masculinos ou femininos de três a cinco meses de idade para a sala de condicionamento. Antes de iniciar o teste pré-condicionamento, limpe uma câmara de plexiglass cilíndrica de 30 centímetros de altura e clara com ácido 1%acético para ser usado como a câmara de contexto A.

Para pré-condicionamento, coloque o mouse no contexto A e deixe que ele se aclimata por três minutos antes de expor o mouse a quatro trilhas SCS de 20 segundos com um intervalo médio pseudoaleatório de 90 segundos entre-ensaios. Após 10 minutos de aclimatação, transfira um mouse para a câmara do contexto A e ative imediatamente o sistema de condicionamento do medo e os programas de coleta de dados. Antes de iniciar um experimento de condicionamento do medo, limpe um gabinete retangular de pelo menos 35 centímetros de altura, 25 por 30 centímetros com um piso de rede elétrica com 70% de etanol para ser usado como a câmara do contexto B.

Em seguida, conecte o amortecedor com o piso da rede elétrica da câmara do contexto B e defina a frequência, o início e a duração dos choques no programa de computador apropriado. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, verifique se a intensidade do choque é fornecida corretamente tanto do amortecedor quanto do piso da grade. Nos dias dois e três, coloque o rato na câmara do contexto B por três minutos antes de expor o animal a cinco pares do SCS co-terminando com um choque de pé ac de um segundo, 0,9 miliamp e um intervalo médio de 120 segundos inter-ensaio.

No final da sessão, coloque o rato de volta na gaiola. Dependendo do objetivo do experimento, submeter os animais a uma sessão de Recall, no quarto dia, coloque o rato na câmara do contexto A por três minutos antes de apresentar o animal com quatro ensaios de SCS sem choque no pé com um intervalo médio pseudoaleatório de 90 segundos entre-ensaios ao longo de 590 segundos para testar a resposta do Recall de Medo do animal. Ou, para testar a Extinção do Medo, no quarto dia, coloque o rato na câmara do contexto B por três minutos antes de submeter o animal a 16 ensaios de SCS sem choque nos pés com um intervalo médio pseudoaleatório de 90 segundos inter-ensaio durante um período de 1.910 segundos.

Para quantificar o comportamento do mouse, no final do experimento, tenha um observador cego para a pontuação de análise dos vídeos gravados para o comportamento de congelamento usando limiares automáticos do detector de congelamento seguido de uma análise quadro a quadro das alterações dos pixels. Defina o congelamento como uma cessação completa dos movimentos corporais, exceto para aqueles necessários para a respiração por um mínimo de um segundo. Marque um salto como exemplo quando todas as quatro patas saem do chão, resultando em um movimento vertical e/ou horizontal.

Quando todo o segmento for analisado, exporte o arquivo marcado com marcadores de congelamento, salto e eventos e extraia os eventos relevantes dos períodos de interesse definidos em uma planilha. Para calcular a duração do congelamento, subtraia o tempo de início a partir do tempo final para cada período de ensaio respectivo. Soma o número total de saltos de uma duração de teste específica.

Para calcular a velocidade do mouse, rastreie as coordenadas do movimento do eixo XY quadro por quadro do centro de gravidade do mouse. Para calcular as pontuações de voo, divida a velocidade média durante cada SCS pela velocidade média durante o pré-SCS de dez segundos e adicione um ponto para cada salto de fuga. Uma pontuação de voo de um indica nenhuma mudança no comportamento de voo do período pré-SCS.

Em seguida, analise os dados para significância estatística utilizando um programa de software de análise estatística adequado. As apresentações de SCS na sessão de pré-exposição não provocam respostas de voo ou congelamento em camundongos. A análise comportamental durante o condicionamento revela que o componente Tom do SCS aumenta significativamente o congelamento em comparação com o congelamento durante o pré-SCS.

As pontuações de voo mudaram significativamente ao longo das sessões, e os ratos exibem velocidades mais altas e mais saltos para a deixa White Noise em comparação com a deixa Tone. Os ratos mostram uma clara transição de comportamento defensivo, exibindo pontuações de voo mais baixas durante o Tom e pontuações de voo mais altas durante o Ruído Branco, com o oposto observado para respostas congelantes. Camundongos submetidos a 16 testes de treinamento de extinção demonstram uma rápida extinção do voo condicionado, com pontuações de luta durante o primeiro bloco de quatro ensaios medindo mais durante o Ruído Branco em comparação com a deixa Tone.

No final da sessão de extinção, o comportamento de voo não é mais provocado por nenhuma das pistas. Congelar ao tom é significativamente maior do que congelar ao Ruído Branco para o primeiro bloco de quatro ensaios durante a extinção. O congelamento induzido por tons diminui ao longo dos 16 ensaios de extinção, enquanto um aumento no congelamento mediado pelo ruído branco é observado.

Na sessão Recall, a exposição ao Ruído Branco em um contexto neutro não provoca voo, pois as pontuações de voo estão abaixo de um. Em vez disso, apresentações de Ruído Branco no contexto neutro provocam respostas de congelamento maiores do que as provocadas pelo Tom. É importante limpar o contexto ao longo do tempo, e é fundamental testar a amplitude de choque e o nível de pressão sonora antes de iniciar um experimento.

Esse paradigma está sendo utilizado atualmente por grupos interessados em entender as complexidades do comportamento defensivo, e podem ser usados para aprofundar nossa compreensão da seleção de ações defensivas.