מדידת נוגדנים הרום Phagocytosis-באופן טבעי כדי Plasmodium falciparum טפילי על ידי אסאי מבוסס ציטומטריה זרימה

פרוטוקול זה מאפשר למדוד את היכולת של נוגדנים לאופוסוניזציה ולהוות את הפגוציטוזיס של פלסמודיום פלציפרום נגוע אריתרוציטים. נוגדנים הקיימים בסרום של אנשים שנחשפו באופן טבעי לזיהום טפיל, כמו גם אלה הנגרמים על ידי חיסון עם אנטיגנים טפילים, ניתן לבדוק. להדגים את ההליך איתי יהיה מיקן ויסטי, טכנאי מהמעבדה שלי.

כדי להקים תרבות תאים THP-1 עבור phagocytosis assay, יום לפני הניסוי לזרוע את התאים בבקבוק תרבות בריבוע 25 ס”מ וריכוז של 2.5 פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר ב THP מדיום תרבות תא אחד. ביום הניסוי, לפחות שעה אחת לפני שהניסוי חוסם לצלחות עגולות של 96 בארות עם 150 מיקרוליטרים של סטרילי 2%FBS ב-PBS ל הבאר. לקציר וטיהור של אריתרוציטים נגועים בטרופוזויטים באמצע עד בשלב מאוחר, הכינו כ־1.2 מיליליטר של תרבות טפילי P falciparum ארוזים ב־10 מיליליטר של מדיום תרבות טפילים, עם לפחות 5% טפילים והוסיפו לעמוד מגנטי.

לשטוף את העמוד עם 50 מיליליטר של תרבות טפיל בינוני. כדי לסלק את אריתרוקיטים נגועים, להסיר את העמוד מן המגנט לשטוף אותו עם 50 מיליליטר של מדיום תרבות טפיל. לאחר מכן, לאסוף את אריתרוציטים נגועים על ידי צנטריפוגה ו resuspend את גלולה במיליליטר אחד של מדיום תרבות טפיל טרי לספירה.

התאימו את ההשעיה הנגועה המטוהרת ב-3.3 פעמים 10 לתאים השביעיים למיליליטר בתרבות הטפילים הבינונית המכילה אתידיום ברומיד, לריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, הסר את פתרון החסימה מצלחת אחת של 96 בארות על-ידי הפלת הצלחת לתוך מיכל פסולת. לאחר מכן להסיר כל עודף על מגבת נייר ולהוסיף 30 microliters של תווית אתידיום ברומיד נגוע מתלה אריתרוציטים לכל אבל אחד טוב במחצית העליונה של הצלחת.

מוסיפים 30 מיקרוליטרים של תרבות טפילים בינוניים לתוך באר ריקה, ו דגירה את הצלחת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, מוסיפים 170 מיקרוליטרים של מדיום תרבות טפילים לכל באר ומציעים את אריתרוציטים נגועים בתחתית הצלחת על ידי צנטריפוגה. הסר את supernatant על ידי הבהבת הצלחת לתוך מיכל פסולת, ולשטוף את האתידם ברומיד שכותרתו אריתרוקיטים נגועים פעמיים נוספות, עם 200 microliters של תרבות טפיל בינוני לגם, כפי שהוכח רק.

לאחר הכביסה השנייה, השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להסיר בזהירות את כל נפח supernatant מכל באר, מבלי להפריע כדורי. ולתלות מחדש את אריתרוציטים נגועים עם תווית אתידיום ברומיד ב-30 מיקרוליטרים של תווי נוגדנים, כולל הבקרות המתאימות ודגימות הבדיקה שהוכנו בעבר במדיום תרבות הטפילים. לאחר מכן, מניחים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות, מוגן מפני אור.

בעוד אריתרוסיטים נגועים הם להיות opsonized, לאסוף את התאים THP-1 על ידי צנטריפוגה, ו resuspend את גלולה ב 12 מיליליטר של טרי, מראש מחומם THP-1 תא תרבות בינוני. לאחר צנטריפוגה שנייה, יש להשתמש מחדש את גלולה במיליליטר אחד של מדיום תרבות התא THP-1 לספירה, ולהתאים את ריכוז התאים לחמש פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר במדיום תרבות התא THP-1. הסר את פתרון החסימה מהצלחת השנייה של 96 בארות והוסף 100 מיקרוליטרים של תאי THP-1 לכל באר.

לאחר מכן, מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא. בסוף הדגירה opsonization, להוסיף 170 microliters של תרבות טפיל בינוני לכל באר של צלחת opsonization, ומסיסים את אריתרוציטים נגועים לתחתית הצלחת על ידי צנטריפוגה. לשטוף את אריתרוציטים נגועים opsonized פעמיים עם 200 microliters של תרבות טפיל בינוני ל הבאר, באמצעות פיפטה רב ערוצית כדי להסיר בזהירות את supernatant לאחר לשטוף השני.

תמשוך מחדש את אריתרוסיטים נגועים opsonized ב 100 microliters של THP-1 מחומם מראש תאים בינוני ל הבאר, ולהעביר 50 microliters של כל מתלה אריתרוסיטים נגועים אופוסוניזציה ל הבאר המתאימה בצלחת phagocytosis. לאחר הוספת כל התאים, מניחים את הצלחת בממגר תרבות התאים למשך לא יותר מ-40 דקות, מוגנים מפני אור. בסוף הדגירה, לעצור את phagocytosis על ידי צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס.

הסר את supernatant ו resuspend כדורי עם 150 microliters של טמפרטורת החדר אמוניום כלוריד lysing פתרון לגם. לאחר שלוש דקות בדיוק, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של קרח קר ב 2%FBS ב PBS כדי לעצור את התמוגה, ומסיסים את התאים שלמים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 200 microliters של קרח טרי קר 2% FBS ב PBS ל הבאר, לכל לשטוף.

לאחר הכביסה הסופית, יש לעשות שימוש חוזר ב-200 מיקרוליטרים של קרח טרי קר 2%FBS ב-PBS ל הבאר. לרכישה וניתוח של ציטומטריית זרימה, טען מיד את התאים על ציטומטר זרימה ולהשתמש בעלילה של פיזור צד ליניארי קדימה לעומת ליניארי עבור בארות ללא אריתרוציטים נגועים לשער את תאי THP-1. לרכוש 10, 000 אירועים בשער זה, ולהשתמש בתאי THP-1 עם אריתרוציטים נגועים opsonized עם שליטה חיובית כדי להגדיר עלילה היסטוגרמה כדי למדוד את עוצמת פלואורסצנטיות אתידיום ברומיד.

לצורך ניתוח, פתח את העלילה ליניארי קדימה לעומת צד ליניארי פיזור עבור בארות ללא אריתרוציטים נגועים, ושער תאי THP-1. לאחר מכן, להגדיר שער חיובי בהיסטוגרמה FL-3 ולהעתיק שערים אלה על כל בארות מדגם אחרים כדי לקבוע את אחוז אתידיום ברומיד חיובי THP-1 תאים. עבור כל מדגם שנבדק, phagocytosis ניתן דיווח כערך מוחלט או כמו phagocytosis היחסי מחושב כאחוז באמצעות הפקד החיובי כמו המקסימום.

יש לבדוק מעת לעת את תאי ה- THP-1 עבור ביטוי פני השטח של קולטן גמא FC על-ידי ציטומטריית זרימה. התאים צריכים להיות שליליים עבור CD16 וחיוביים עבור CD32 ו- CD64. בניסוי אופסוניזציה זה, תאי THP-1 היו מגודרים תחילה על פי פרופילי פיזור קדימה וצד שלהם, כדי לאפשר כימות של אחוז התאים המסומן באתידיום ברומיד, המעיד על תאים שיש להם phagocytized לפחות נוגדן אחד אופוסוניזציה נגוע אריתרוציטים.

דגימות הבקרה השלילית צריכות ליצור שיא שלילי יחיד בערוץ FL3, עם מעט אירועים שנצפו בסמן האתידיום ברומיד. בהתאם לכך, ערכי הפאגוסיטוזיס הממוצעים, הן כתאי THP-1 חיוביים-אתידיום מוחלט והן כאחוזי phagocytosis יחסיים, צריכים להיות נמוכים מאוד. לעומת זאת, השליטה החיובית צריכה ליצור עקבות עם שתי פסגות, שיא שלילי ושיא חיובי ומופרד היטב הממוקם בתוך סמן האתידיום ברומיד.

ערכי הפאגוציטוזיס הממוצעים הם בדרך כלל הגבוהים ביותר עבור השליטה החיובית, ואחריו הבריכה הנשית החשופה למלריה והשליטה של האישה החשופה למלריה. למרות שמתודולוגיה זו יוצרת תוצאות עקביות, נצפו סטיות במקדם השיפוע של הקווים המותאמים. לכן, מומלץ להשתמש בערכים יחסיים, במיוחד אם לא ניתן להפעיל את כל הדגימות בניסוי יחיד.

הקפד לתכנן את הניסוי בקפידה מראש, הכנת שני תאי THP-1 ואת הטפילים בהתאם, באמצעות trophocytes רק עם טוהר גדול מ 80%בנוסף, הקפד תמיד לכלול את הפקדים המתאימים, כדי לאפשר את איכות הניסוי להיות מוערך להקל על ניתוח נתונים.