Superupplösning Live Cell Imaging av subcellulära strukturer

Vårt protokoll använder regelbundna fluorofor sonder och enkla prov förberedelse tekniker som upprätthåller den avbildade cellen i fysiologiskt skick för att studera mycket dynamiska cellulära process och detaljerade sub-cellulära strukturer. Denna teknik gör det möjligt för oss att undersöka cellulära processer med superupplösning och under fysiologiska förhållanden under en längre period utan att offra vare sig den speciella eller tillfälliga upplösningen. Börja med att skära ett 12 till 14 kilodalton molekylviktsavskuret dialysmembran i små bitar och blötlägg bitarna med 100 mikroliter levande cellmedel i cirka fem minuter.

Medan membranen blötläggs, skär den yttre ringen på ett 50 milliliter rör i små bitar och sterilisera bitarna i 70% etanol. För testiklar dissekering och montering, överför tio två till tre dagar gamla sövd hanflugor i en dissekeringsform under ett dissekerande mikroskop och använd fina tång för att ta bort testikorna. När alla testiklar har samlats in, tvätta testikel två gånger i levande cellmedium och använd en pipettspets för att sprida 100 till 150 mikroliter levande cellmedel till den beredda glasbottenformen.

Använd fina tångar för att överföra flugtesten till mitten av skålen och ta bort alla utom cirka 10 mikroliter av mediet. Placera snabbt det fört blöta membranet på testikorna och placera två till tre små plastvikter på membranet. Tillsätt omedelbart 100 till 150 mikroliter färskt levande cellmedium och placera tillbaka ringen på skålens förhöjda sida.

Placera locket tillbaka på ringen och virvla runt ett mjukpapper i vatten innan du lägger papperet på täckspingen. Täck sedan skålen med ett lock och säkra skålen på scenen i ett superupplösningsmikroskop. För bakteriecellsavbildning, öppna bildframställningsprogramvaran och tänd det överförda ljuset.

Använd 63X-målet för att fokusera på testiklarvävnaden och slå på lasrarna. Klicka på Live”för att hitta könsceller. Justera fokus och klicka på Bildrutestorlek” för att ställa in bildrutestorleken till mellan 512 och 1024 med 1 024 pixlar och I genomsnitt”för att ställa in bildrutegenomsnittet till en eller två.

Klicka på Bakgrundsvinst”för att ställa in elektronförökningsvinsten till mindre än 800 och Lasrar”för att ställa in lasereffekten på 1%till 2%Zooma in på regionen eller cellen av intresse för att minska bildförvärvstiden och för att minska fotoblekningen och bekräfta att bilden har konfigurerats optimalt innan du klickar på Startexperimentet”för att starta tidsfördröjningsbilden. Om Airyscan Acquisition inte är konfigurerat optimalt”visas klickar du på Optimal”i bildrutestorleken, Z-Stack och Scan Area”-avsnitten och optimerar tidsintervallet, antalet Z-segment och varaktigheten för timelapse-avbildningen, enligt experimentell design och typ av prov. Efter avbildning väljer du Bearbetning, Batch och Airyscan Processing och väljer de bilder som ska bearbetas.

Klicka sedan på Kör process”för att få superupplösningsbilderna. Levande cell imaging av drosophila testiklar uttrycker alfa tubulin GFP i tidiga skeden könsceller med hjälp av en snurrande skiva confocal mikroskop, tillåter visualisering av den asymmetriska intensiteten av GFP signaler vid två centrrum, som en ljusare signal vid modern centrosome och en relativt svagare signal på dottern centrosomes. Skillnaden i ljusstyrka återspeglas sannolikt av den temporala asymmetrin i mikrotubulekärnan, men den detaljerade morfologin och kvantiteten av mikrotubbulerna kan inte lösas med hjälp av snurrande skiva konfokal mikroskopi.

Däremot tillåter live cell superupplösning imaging visualisering och kvantifiering av mikrotubule morfologi och siffror. Denna förbättrade upplösning avslöjar också mönster av asymmetrisk mikrotubule nukleation, förlängning och ökad interaktion med kärnmembranet. Levande cellavbildning möjliggör också visualisering av asymmetrisk nukleär membraninvaginering, men inte av enskilda mikrotubuli som direkt kommer in i kärnan.

Däremot tillåter denna live cell super resolution teknik direkt observation av dessa händelser genom samtidig bildbehandling av både mikrotubuler och nukleära lamina. Under metafas kan båda systercentromererna detekteras som en signal med snurrande skivmikroskopi, även om mikrotubule centralfästet inte kan observeras. Däremot tillåter superupplösning live imaging visualisering av mikrotubule centromere-tillbehöret i tidig profas.

Var noga med att placera ett membran över testikelerna för att säkerställa att de inte rör sig eller flyter under avbildning och för att optimera mikroskopinställningarna för att undvika fotoblekning och fototoxicitet. Det finns många sätt att tillämpa denna metod, till exempel för att undersöka proteindynamik, linjär stress eller cellulärt försvar och processer.